miRNA 研究全套解決方案

      北(běi)京唯尚立德公司擁有人(rén)類miRNA mimics 及antagomir文庫（1000×2），小鼠miRNA mimics及antagomir文庫（600×2），大(dà)鼠miRNA mimics及antagomir文庫（500×2）。這(zhè)些文庫可(kě)以應用(yòng)于大(dà)規模高(gāo)通(tōng)量篩選，助力廣大(dà)科研同仁系統、高(gāo)效的(de)研究功能，完成項目。

服務内容：

情景一：鑒定miRNA的(de)靶基因
一、螢光(guāng)素酶（Luciferase）雙螢光(guāng)報告基因實驗鑒定miRNA靶點
a、實驗概述：
構建包含miRNA靶位點的(de)luciferase報告基因，與miRNA mimics共轉到細胞當中，通(tōng)過熒光(guāng)素酶活性檢測，即可(kě)分(fēn)析出miRNA對(duì)潛在靶基因的(de)調控作用(yòng)，可(kě)用(yòng)于miRNA調控潛在靶基因的(de)驗證。既可(kě)以小規模實驗，也(yě)可(kě)高(gāo)通(tōng)量篩選。
原理(lǐ)圖：

b、步驟流程：
1.預測miRNA的(de)靶基因及靶位點
協助客戶利用(yòng)Targetscan，Pictar，miRNA.org，RNA22等常用(yòng)軟件預測miRNA的(de)binding位點。

2.miRNA靶點鑒定

ii、Luciferase報告基因構建：
  将目的(de)片段組裝到報告基因載體，1周，800/個(gè)。
   iii、miRNA表達載體構建：
  2周，可(kě)以擴增用(yòng)于其他(tā)實驗，800/個(gè)。
  推薦：miRNA mimics合成：1-2周，2 OD，贈送陰性對(duì)照(zhào)，400/個(gè)。（二選一）
   iv、Luciferase實驗：
  每個(gè)靶點都要做(zuò)一個(gè)對(duì)照(zhào)；每個(gè)樣品包含内參和(hé)三組重複，根據樣品數而定周期，400*2/個(gè)靶點。

成功實例：

圖 1-2

二、Luciferase突變實驗鑒定miRNA靶點
a、實驗概述：
對(duì)于前面有效果的(de)miRNA靶基因，将miRNA的(de)binding位點，尤其是seed區(qū)突變掉，造成miRNA無法結合，檢測luciferase信号是否恢複。原理(lǐ)圖：（如圖1-1）
b、步驟及流程
   1.Luciferase報告基因構建：PCR法，每段突變20個(gè)堿基之内，1-2周
   2.Luciferase實驗：每個(gè)樣品包含内參和(hé)三組重複，根據樣品數而定周期。

成功實例：

圖 1-3

三、mRNA水(shuǐ)平鑒定miRNA靶點
  a、實驗目的(de)：由于miRNA作用(yòng)機制有兩個(gè)方面，降低mRNA的(de)表達水(shuǐ)平和(hé)抑制mRNA的(de)翻譯水(shuǐ)平，所以檢測靶點基因的(de)mRNA水(shuǐ)平變化(huà)将作爲一個(gè)參考數據，用(yòng)于分(fēn)析miRNA作用(yòng)靶點基因的(de)機制。
  b、實驗概述：對(duì)于前面有效果的(de)miRNA靶基因，檢測mRNA水(shuǐ)平是否被miRNA下(xià)調。
  c、具體内容：将miRNA mimics和(hé)陰性參照(zhào)轉染到細胞中，48-72小時(shí)候，提取RNA，熒光(guāng)定量PCR檢測靶點基因的(de)mRNA水(shuǐ)平。900/個(gè)靶點+900/對(duì)照(zhào)，2個(gè)靶點起訂。

四、Western Blot實驗鑒定miRNA靶點
  a、實驗目的(de)：由于miRNA作用(yòng)機制有兩個(gè)方面，降低mRNA的(de)表達水(shuǐ)平和(hé)抑制mRNA的(de)翻譯水(shuǐ)平，所以檢測靶點基因的(de)蛋白水(shuǐ)平變化(huà)将作爲一個(gè)參考數據，能全面反映靶點基因的(de)蛋白表達水(shuǐ)平的(de)變化(huà)，結合mRNA表達水(shuǐ)平變化(huà)，有助于分(fēn)析miRNA作用(yòng)靶點基因的(de)機制。
  b、實驗概述：對(duì)于前面有效果的(de)miRNA靶基因，檢測蛋白水(shuǐ)平是否被miRNA下(xià)調。
Western Blot實驗：每個(gè)樣品包含内參，客戶提供一抗。
  c、具體内容： 将miRNA mimics和(hé)陰性參照(zhào)轉染到細胞中，48-72小時(shí)後，裂解細胞進行Western Blot檢測靶點蛋白的(de)水(shuǐ)平變化(huà)。800/個(gè)靶點+800/對(duì)照(zhào)，2個(gè)靶點起訂。
成功實例：

圖 1-4

五、使用(yòng)靶基因的(de)siRNA驗證靶點
實驗概述：
  miRNA過表達會引起細胞表型的(de)變化(huà)，例如遷移、增殖、凋亡，以及靶基因下(xià)遊基因表達量變化(huà)等等。爲了(le)證明(míng)miRNA是通(tōng)過負調控靶基因而引起的(de)這(zhè)些變化(huà)，可(kě)以使用(yòng)靶基因的(de)siRNA，檢測是否會引起同樣的(de)變化(huà)。
詳見基因沉默服務内容。

六、使用(yòng)miRNA的(de)抑制劑（Antagomir）驗證靶點
  原理(lǐ)：miRNA antagomir是經過特殊化(huà)學修飾的(de)miRNA拮抗劑，通(tōng)過與體内的(de)成熟miRNA強競争性結合，阻止miRNA與其靶基因mRNA的(de)互補配對(duì)，抑制miRNA發揮作用(yòng)。
  優勢：與普通(tōng)抑制劑相比，miRNA antagomir在動物(wù)體内外具有更高(gāo)的(de)穩定性和(hé)抑制效果，且能克服體内細胞膜、組織等障礙富集于靶細胞。（Antagomir的(de)合成：單鏈的(de)特殊修飾的(de)RNA，2 OD）
  實驗概述：對(duì)于内源有表達的(de)miRNA，可(kě)以使用(yòng)Antagomir，檢測靶蛋白表達量是否恢複，檢測是否會引起過表達miRNA相反的(de)變化(huà)。對(duì)于内源沒有表達的(de)miRNA，可(kě)以先構建miRNA穩定表達細胞系，再進行上述實驗。細胞系構建詳參慢(màn)病毒穩轉表達細胞系構建。

七、通(tōng)過rescue靶蛋白檢測功能來(lái)驗證靶點
  實驗概述：對(duì)于内源有表達的(de)miRNA，可(kě)以構建cDNA表達質粒，過表達靶蛋白，檢測是否會有rescue miRNA的(de)抑制效果。對(duì)于内源沒有表達的(de)miRNA，可(kě)以構建miRNA穩定表達細胞系，再進行上述實驗。細胞系構建詳參慢(màn)病毒穩轉表達細胞系構建。

八、miRNA靶基因信号通(tōng)路總結
概述：利用(yòng)prePPI,KEGG等生物(wù)信息學軟件，總結性分(fēn)析miRNA調控靶基因及下(xià)遊信号通(tōng)路。
成功實例：

圖 1-5

情景二：已知現象，未知miRNA，發現您感興趣的(de)miRNA
内容：利用(yòng)高(gāo)通(tōng)量篩選手段，針對(duì)您感興趣的(de)現象或者細胞行爲，篩選出與此相關的(de)miRNA。
詳情見高(gāo)通(tōng)量篩選服務内容。

情景三：已知基因，鑒定調控它的(de)miRNA
内容：構建包含目的(de)基因3’UTR的(de)luciferase報告基因，與候選miRNA mimics共轉到細胞當中，通(tōng)過熒光(guāng)素酶活性檢測，即可(kě)分(fēn)析出miRNA對(duì)目的(de)基因的(de)調控作用(yòng)，既可(kě)以小規模實驗，也(yě)可(kě)高(gāo)通(tōng)量篩選。