T7 體外轉錄試劑盒

産品組成：

注意：收到試劑盒後，使用(yòng)前請離心，避免試劑滞留在離心管蓋上。

保存與運輸：

産品于 -20℃ 保存，避免反複凍融；采用(yòng)藍冰運輸。

說明(míng)：

T7 RNA 聚合酶對(duì) T7 噬菌體啓動子具有高(gāo)度的(de)特異性，以上遊帶有 T7 啓動子的(de)目的(de)基因的(de)線性化(huà) DNA 爲模闆使用(yòng)此試劑盒可(kě)體外快(kuài)速将模闆 DNA 轉錄成相應的(de) RNA.

T7 RNA 聚合酶啓動子同源序列：

+1

T7(5’→3’) TAATACGACTCACTATAGGG

G(+1) 是 RNA 轉錄的(de)起始位點，正義 RNA 合成要求将目标序列置于啓動子的(de)下(xià)遊。

應用(yòng)：

1/ CRISPR 系統中的(de) gRNA 轉錄，轉錄的(de) gRNA 可(kě)以快(kuài)速進行體外準确剪切，或者顯微注射。

2/ siRNA 的(de)合成。

使用(yòng)步驟：

一、轉錄模闆 DNA 的(de)準備

可(kě)以采用(yòng)下(xià)面兩種方式之一來(lái)準備體外轉錄模闆 DNA:

1/ 線性化(huà)的(de)質粒 DNA: 含有 T7 RNA 聚合酶啓動子且方向正确，在目的(de)基因下(xià)遊切割使質粒 DNA 線性化(huà)；

2/ PCR 産物(wù)：T7 RNA 聚合酶啓動子必須定位在目的(de)基因的(de)上遊。

二、RNA 的(de)體外轉錄

反應體系：

 以上混合後，37℃ 反應 1～2 小時(shí)。

反應結束後，加入 1 μL DNase I, 37℃ 反應 30 分(fēn)鐘(zhōng)。

三、RNA 的(de)回收與提取：

1/ 加入 115μL DEPC 水(shuǐ)，15μL Stop Solution 混勻後，加入 2 倍體積(300μL)的(de)無水(shuǐ)乙醇（自備），充分(fēn)混勻後，-20℃ 凍存 30min 以上（若 RNA 小于 300nt, -20℃ 凍存 3 小時(shí)以上）。

2/ 13000rpm 4℃ 離心 20min, 去除上清保留沉澱。

3/ 加入 300μL 的(de) 70％ 冷(lěng)乙醇清洗（自備，注意用(yòng) DEPC 水(shuǐ)配制），13000rpm 4℃ 離心 15min, 去除上清保留沉澱，待乙醇晾幹後，加入 DEPC 水(shuǐ)溶解 RNA 沉澱。

4/ 測量 RNA 濃度，直接用(yòng)于後續實驗，或者 -80℃ 保存待用(yòng)。

注：以上的(de)操作請全部購(gòu)買和(hé)使用(yòng) RNase free 的(de)槍頭及 EP 管，ddH₂O 用(yòng) DECP 處理(lǐ)。