多(duō)基因片段快(kuài)速拼接克隆試劑盒

産品組成：

注意：收到試劑盒後，使用(yòng)前請離心，避免液體滞留在離心管蓋、管壁上。

保存條件：-80℃ 保存一年；或 -20℃ 保存兩個(gè)月(yuè)。請将産品于 -80℃ 保存，避免反複凍融。

Easy Assembly反應示意圖：

Easy Assembly 通(tōng)過體外重組方法一步完成多(duō)個(gè)(2-6 個(gè)) DNA 片段無縫拼接連接(見下(xià)圖)。Easy Assembly 是一種新穎的(de)分(fēn)子克隆方法，不需要傳統克隆方式的(de)酶切連接，僅需要 15-70bp（建議(yì) 50bp）的(de)同源接頭，并可(kě)以随意修改接頭部位的(de)序列，使得(de) DNA 克隆方便

快(kuài)捷，連接更加精确，且反應時(shí)間短。

Easy Assembly 的(de)優勢：

1/ 實現多(duō)個(gè) DNA 片段同時(shí)拼接

2/ 拼接 DNA 片段大(dà)小範圍寬(260bp-10Kbp)，實現大(dà)片段 DNA 的(de)克隆

3/ 試驗操作簡單，避免了(le) DNA 酶切、回收、連接等分(fēn)子克隆操作，操作時(shí)間大(dà)大(dà)縮短，約半小時(shí)可(kě)完成反應

4/ 反應效率高(gāo)

适用(yòng)範圍：

1/ 載體≤15k; 連接片段長(cháng)度 260bp-10Kbp; 連接 DNA 片段數目≤10

2/ 接頭長(cháng)度：15-70bp, 40-50bp 最佳

3/ DNA 片段推薦濃度：0.002-0.010pmol/片段

4/ 濃度計算(suàn)：pmol=DNA 質量(ng)×1000/(堿基對(duì)數目×650D)。例如，50ng 5kb 的(de)雙鏈 DNA 爲 0.015pmol

實驗步驟：

1/ 分(fēn)别通(tōng)過 PCR 或者酶切準備進行拼接的(de) DNA 片段，定量。

2/ 取一支 easy Assembly mix 離心，避免液體殘餘管蓋、管壁上，放置在冰上。

3/ 将各個(gè) DNA 片段按等摩爾量混合，取總量 2.5μl 的(de) DNA 片段，加入到一支 easy Assembly mix 管中，混勻。

4/ 立即置于 50℃（可(kě)在 PCR 儀上進行），反應 30min-60min 後，然後進行 DNA 的(de) E.coli 轉化(huà)，複蘇，塗闆。

注意事項：

1/ 加入的(de) DNA 片段應爲等摩爾量。

2/ 加樣過程于 4℃ 操作。

3/ 當出現下(xià)列情況建議(yì)使用(yòng) 2 倍反應體系：連接 DNA 片段多(duō)于 5 段，或者單片段長(cháng)度大(dà)于 6k, 接頭長(cháng)度小于 15bp 或大(dà)于 50bp, 反應片段摩爾量低于 0.0002pmol.

4/ 若接頭大(dà)于 70bp, 建議(yì)适當延長(cháng)反應時(shí)間。

5/ 多(duō)片段反應時(shí)，接頭應避免出現重複序列，或者拼接片段中除接頭外盡量不要再有接頭序列，由于反應原理(lǐ)是體外同源重組，将可(kě)能出現這(zhè)些同源序列的(de)意外拼接。

6/ 建議(yì)使用(yòng) DH5α 感受态細胞進行轉化(huà)。

7/ 建議(yì)轉化(huà)後複蘇 45min-1h.

同源接頭設計例子：

下(xià)面序列是需要拼接的(de)相鄰 DNA 序列，分(fēn)别用(yòng)紅色字體與黑(hēi)色字體标示。所以接頭的(de)同源序列就直接取紅色與黑(hēi)色字體的(de)交接處的(de) DNA 序列：

GCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTCTACCACCACTCTGTGGCACTTTCCAATTTCAGACTCTGATCCGGACACT

CTTACAGGGNNNNNNNATGCTGGAGAAGTTCTGCAACTCTACTTTTTGGAATTCCTCATTCCTGGACAGTCCGGAGGCAGACCTGCCACTTTGTTTT

GAGCAAACTGTTCTGGTGTGGATTCCCTTGGGCTTCCTATGGCTCCTGGCCCCCTGGCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTC

TACCACCAAACTCTATCTTGCTAAGCAGGTATTCGTTGGTTTTCTTCTTATTCTAGCAGCCATAGAGCTGGCCCTTGTACTCACAGAAGACTCTGGAC

AAGCCACAGTCCCTGCTGTTCGANNNNNNNNNNTGATCTTTTCAGCATTTTCAGAAAATAATGAGT

CATCAAATAATCCATCA

因此，接頭同源序列可(kě)以加在引物(wù)上，如下(xià)：

片段 1 正向引物(wù)：根據上一段拼接的(de)序列而定

片段 1 反向引物(wù)：

TGGTGGTAGAGGATCTCTTGGTCCTGGATTTATACACGTGGAGAAGCTGC

片段 2 正向引物(wù)：

GCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTCTACCACCA

片段 2 反向引物(wù)：根據下(xià)一段拼接的(de)序列而定

片段 1 和(hé)片段 2 的(de) PCR 産物(wù)，再加上其他(tā) DNA 片段将可(kě)以通(tōng)過 Easy Assembly Cloning Kit 無縫拼接在一起了(le)。