T7 核酸内切酶 I (T7 endonuclease I, T7E1 )

應用(yòng)
■ 基因突變和(hé)SNP的(de)檢測，可(kě)應用(yòng)于TALEN、CRISPR/CAS9形成的(de)突變體檢測
■ 識别錯配 DNA，分(fēn)解四方向交叉 DNA 或分(fēn)支 DNA
■  檢測或切割異源二聚體 DNA 和(hé)切割 DNA
■  随機切割線性 DNA 進行 shot-gun 克隆

概述
T7 核酸内切酶 I 識别并切割不完全配對(duì) DNA、十字型結構 DNA、Holliday 結構或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢(màn)的(de)速度切割或切刻雙鏈 DNA。該酶切割錯配堿基 5′ 端的(de)第一、第二或第三個(gè)磷酸二酯鍵。

來(lái)源
重組T7 核酸内切酶 I (T7 endonuclease I, T7E1 )

反應條件
Buffer [50 mMNaCl，10 mMTris-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）], 即同1X NEBuffer 2，37℃溫育。

質保聲明(míng)
T7 核酸内切酶 I 經過嚴格的(de)質控檢測，确保該産品具有最高(gāo)的(de)活性和(hé)純度。請使用(yòng)前務必仔細閱讀本手冊。

單位定義
1 單位指在50 μl反應體系，37℃，1 小時(shí)将1 μg超螺旋十字型結構的(de)pUC（AT）質粒酶切成 90% 以上的(de)線性DNA所需要的(de)酶量。

注意事項
T7 核酸内切酶 I 是一種具有底物(wù)結構選擇性的(de)酶。該酶以不同的(de)活性作用(yòng)于不同的(de) DNA 底物(wù)。切割特定底物(wù)時(shí)，必須控制酶量和(hé)反應時(shí)間。反應溫度超過 42℃時(shí)，會增加非特異性核酸酶活性。避免反應溫度超過55℃，會導緻酶活性降低。
T7E1酶切法檢測突變體實驗步驟
1、PCR擴增出帶有突變位點(如TALEN or CRISPR/Cas9的(de)target site) DNA片段，長(cháng)度約500bp，突變位點最好不位于PCR片段中央，這(zhè)樣将切割出兩條大(dà)小不同的(de)帶。
2、突變體DNA與野生型DNA的(de)PCR産物(wù)按如下(xià)體系進行混合，進行加熱(rè)變性、退火複性處理(lǐ)。

3、建議(yì)退火程序：（PCR儀）
        95℃ 5 min
        95℃ 2 sec
        -0.1℃/cycle, 200 times    
        75℃ 1 sec
        -0.1℃/cycle, 600 times
        16℃ 2 min
4、上述反應體系退火後分(fēn)别加入0.5μl T7E1酶，37℃反應30 min後，立刻跑2%的(de)瓊脂糖凝膠電泳檢測分(fēn)析酶切結果。（放置時(shí)間過長(cháng)可(kě)能會導緻PCR産物(wù)全部降解。）

陽性參照(zhào)

陽性參照(zhào)是一個(gè)堿基的(de)點突變檢測。
使用(yòng)本試劑盒提供陽性參照(zhào)引物(wù)的(de)混合物(wù)：
Control-GC-F    ACACCTGATCAAGCCTGTTC
Control-GC-R    CGCCAAAGAATGATCTGCG
分(fēn)别以陽性DNA Control C和(hé)Control G爲模闆，PCR擴增出600bp的(de)陽性DNA片段，點突變标示如下(xià)：

陽性參照(zhào)可(kě)以分(fēn)别單獨PCR擴增後， PCR産物(wù)等量混合，或者混合DNA模闆進行PCR擴增，PCR産物(wù)進行加熱(rè)變性、退火複性處理(lǐ)後，用(yòng)T7E1酶切，産生400bp+200bp兩個(gè)端片段。

使用(yòng)限制
本試劑僅限用(yòng)于科學研究。

儲存與安全
本品4℃運輸，儲存于-20℃，有效期12個(gè)月(yuè)。長(cháng)期儲存請置于-80℃。
本品采用(yòng)藍冰運輸，藍冰在使用(yòng)前在-80℃冷(lěng)凍至少72小時(shí)。實驗證明(míng)，使用(yòng)上述方法運輸，即使到貨時(shí)藍冰已經融化(huà)，泡沫塑料盒中的(de)溫度仍然能保持在4℃或4℃以下(xià)24小時(shí)。比較幹冰運輸的(de)産品，其活性和(hé)穩定性無任何差異。産品純化(huà)整個(gè)過程都在4℃進行，且其貯存液經過優化(huà)，對(duì)保持酶活的(de)穩定性起到重要作用(yòng)。産品中含有50%甘油，可(kě)以使酶在-35℃下(xià)保持液态，若使用(yòng)幹冰運輸，酶将被冷(lěng)凍，發生反複凍融可(kě)能會導緻酶