Cas9 核酸内切酶 (Cas9 DNA endonuclease)

概述：

CRISPR/Cas 是細菌和(hé)古細菌在長(cháng)期演化(huà)過程中形成的(de)一種适應性免疫防禦，可(kě)特異剪切外源的(de)病毒及 DNA 以對(duì)抗入侵。

人(rén)工改造過的(de) Cas9/gRNA 系統通(tōng)過 gRNA(short guide RNA) 引導 Cas9 蛋白識别并剪切帶有 gRNA 靶點的(de)雙鏈 DNA, 用(yòng)于基因敲除和(hé)精确編輯 DNA 等操作。

來(lái)源：

重組 Cas9

應用(yòng)：

1/ Cas9/gRNA 特異位點體外剪切 DNA, 如 plasmids, genomic DNA, PCR product

2/ 體外檢測 gRNA 的(de)剪切靶點 DNA 的(de)效率

3/ Cas9 蛋白結構與功能研究

反應條件：

1×Buffer [20mM HEPES, pH 7.5, 150mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.1mM EDTA, 0.5mM DTT], 37℃ 溫育。

質保聲明(míng)：

Cas9 經過嚴格的(de)質控檢測，确保該産品具有最高(gāo)的(de)活性和(hé)純度。請使用(yòng)前務必仔細閱讀本手冊。

單位定義：

在 50μl 反應體系中，37℃, gRNA 足量時(shí)，1U 等于 1h 能将 1ug 質粒或線性 DNA 完全酶切所需的(de) Cas9 蛋白量。

注意事項：

1/ Cas9 切割 dsDNA 效率與 gRNA 靶點序列有關，每個(gè) gRNA 的(de)效率都會不同。

2/ 所用(yòng)槍頭管子等都必須是 RNase free 的(de)，gRNA 可(kě)以适當多(duō)加，防止因爲部分(fēn)降解而降低酶切效率。

Cas9 體外酶切法檢測 gRNA 靶點效率實驗步驟：

1/ 帶有 gRNA 靶點的(de)質粒或 PCR 擴增出的(de) DNA 片段，gRNA 靶點最好不位于 PCR 片段中央，這(zhè)樣将切割出兩條大(dà)小不同帶便于判斷。

2/ gRNA 靶點設計與體外轉錄準備見唯尚立德 cas9/gRNA 質粒構建試劑盒。

3/ 反應體系：

瓊脂糖凝膠電泳檢測分(fēn)析酶切結果。

使用(yòng)限制：本試劑僅限用(yòng)于科學研究。

儲存與安全：

本品 4℃ 運輸，儲存于 -20℃ 有效期 12 個(gè)月(yuè)。長(cháng)期儲存請置于 -80℃.

本品采用(yòng)藍冰運輸，藍冰在使用(yòng)前在 -80℃ 冷(lěng)凍至少 72 小時(shí)。實驗證明(míng)，使用(yòng)上述方法運輸，即使到貨時(shí)藍冰已經融化(huà)，泡沫塑料盒中的(de)溫度仍然能保持在 4℃ 或 4℃ 以下(xià) 24 小時(shí)。比較幹冰運輸的(de)産品，其活性和(hé)穩定性無任何差異。

産品純化(huà)整個(gè)過程都在 4℃ 進行，且其貯存液經過優化(huà)，對(duì)保持酶活的(de)穩定性起到重要作用(yòng)。産品中含有 50% 甘油，可(kě)以使酶在 -35℃ 下(xià)保持液态，若使用(yòng)幹冰運輸，酶将被冷(lěng)凍，發生反複凍融可(kě)能會導緻酶活性下(xià)降。