品系基本信息
特性和(hé)用(yòng)途
TALEN質粒設計與構建
TALEN靶向敲除基因原理(lǐ)簡介
TALE技術(Transcription activator-like effectors)是一種嶄新的(de)分(fēn)子生物(wù)學工具。科學家發現，來(lái)自植物(wù)細菌Xanthomonassp的(de)TAL蛋白的(de)核酸結合域的(de)氨基酸序列與其靶位點的(de)核酸序列有恒定的(de)對(duì)應關系。利用(yòng)TAL的(de)序列模塊，可(kě)組裝成特異結合任意DNA序列的(de)模塊化(huà)蛋白。TALEN(Transcription activator-like effector(TAL) nucleases)技術是基于TALE與人(rén)工改造的(de)核酸内切酶的(de)切割域(FokI)構建針對(duì)任意特定核酸靶序列的(de)重組核酸酶。通(tōng)過TAL的(de)DNA識别域結合到靶位點上，及FokI切割域形成二聚體後，可(kě)特異性對(duì)目标DNA序列實現切斷。在随後的(de)非同源末端連接修複過程中，斷開的(de)DNA雙鏈會由于堿基的(de)随機增減從而以一定的(de)概率實現目标基因功能的(de)缺失。
将識别特異DNA序列的(de)TALE與内切核酸酶FokI偶聯，可(kě)構建成剪切特異DNA序列的(de)内切酶TALEN。而且FokI需形成二聚體方能發揮活性，大(dà)大(dà)減少了(le)随意剪切的(de)幾率。在實際操作中，需在目标基因的(de)編碼區(qū)或外顯子和(hé)内顯子的(de)交界處選擇兩處相鄰（間隔13-22堿基）的(de)靶序列（一般16-20個(gè)堿基）分(fēn)别進行TALE識别模塊構建。将這(zhè)兩個(gè)相鄰靶點識别模塊（分(fēn)别）融合克隆到FokI的(de)N-末端，形成真核表達載體，得(de)到TALEN質粒對(duì)。
将TALEN質粒對(duì)共轉入細胞中可(kě)實現靶基因敲除。TALEN質粒對(duì)共轉入細胞後，表達的(de)融合蛋白，分(fēn)别與靶位點特異結合，由于兩個(gè)TALEN融合蛋白中的(de)FokI臨近，形成二聚體，發揮非特異性内切酶活性，在兩個(gè)靶位點之間剪切DNA，形成DSB（Double-Strand Breaks）,誘發DNA損傷修複機制。細胞可(kě)以通(tōng)過NHEJ（Non-homologous End Joining）修複DNA，在此修過程中或多(duō)或少地删除或插入了(le)一定數目的(de)堿基，造成移碼，形成目标基因敲除突變體。
服務内容
TALEN質粒構建全套解決方案
步驟 | 服務内容 | 配套産品 |
明(míng)确物(wù)種和(hé)載體 | 不同物(wù)種不同載體，清單請詳見:Talen（增強型）打靶質粒構建試劑盒 | |
設計靶點 | 一般在不同轉錄産物(wù)的(de)共同外顯子上設計3-5個(gè)靶點，靶點位置盡量在基因CDS的(de)前1/3，ATG之後，不在最後一個(gè)exon上，最好能破壞重要的(de)domain和(hé)所有的(de)轉錄産物(wù)isoform。 | |
合成 | 合成前請檢測靶點是否存在SNP | e-TALEN構建試劑盒 |
靶點切割活性檢測 | 293T細胞内檢測SSA活性 | SSA活性報道質粒構建試劑盒 |
内源活性驗證（有條件選擇） | 若目的(de)細胞轉染效率高(gāo)，如293T細胞，可(kě)轉染72h後提基因組，擴增靶序列，T7E1酶切驗證，進一步測序驗證。 | T7E1酶 |
雙元載體連接（有條件選擇） | 連接到植物(wù)或釀酒酵母的(de)雙元載體上 | 植物(wù)雙元載體、釀酒酵母雙元載體 |
驗證數據
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京公網安備 11011402010692号
