品系基本信息
特性和(hé)用(yòng)途
基因敲除細胞系構建服務
預試驗：（一個(gè)月(yuè)）
1、細胞的(de)轉染效率：嘗試各種轉染方法，如Lipo2000、LTX、電轉等，以期找到轉染效率相對(duì)高(gāo)的(de)方式。
2、藥篩濃度檢測：如果轉染效率不高(gāo)，而過流式對(duì)細胞損傷很大(dà)，需要做(zuò)抗性篩選，檢測出殺死細胞的(de)篩選藥物(wù)的(de)最小濃度。
3、單克隆培養情況：觀察細胞是否可(kě)以單克隆培養，起碼需要兩周時(shí)間培養才能檢測單克隆培養周期。這(zhè)個(gè)周期很大(dà)程度影(yǐng)響了(le)細胞的(de)檢測周期。
4、細胞中目标基因存在多(duō)個(gè)拷貝，這(zhè)樣的(de)敲除将大(dà)大(dà)增加了(le)工作的(de)難度。
問題與分(fēn)析：
一、敲除的(de)不确定性：
1、設計多(duō)個(gè)靶點都沒有内源活性，可(kě)能是切割區(qū)域内存在染色質複雜(zá)結構，建議(yì)換一個(gè)新的(de)區(qū)域。（參考文獻NAR，2014年
2、篩選一輪需要檢測100-200個(gè)單克隆細胞，約一個(gè)月(yuè)時(shí)間。要拿到純合子一般需要多(duō)輪篩選
二、緻死基因的(de)敲除風險：
1、緻死：如細胞周期調控基因、House keeping基因等，敲除後有可(kě)能導緻細胞死亡或者狀态不佳。因此無法獲得(de)純合子的(de)細胞株。
2、關鍵基因：這(zhè)些基因的(de)敲除有可(kě)能導緻細胞的(de)生長(cháng)狀态不佳。
3、其他(tā)：少數基因獲得(de)純合子後，在增殖過程中，生長(cháng)狀态會變的(de)越來(lái)越差，最終導緻無法運輸。
敲除方案：
步驟 | 服務内容 | 配套産品 | |
預試驗 | 詳見上面 | ||
選擇打靶技術 | TALEN（優先） | CRISPR/CAS9（有脫靶風險） | |
設計靶點 | 一般在不同轉錄産物(wù)的(de)共同外顯子上設計9個(gè)靶點，靶點位置盡量在基因CDS的(de)前1/3，ATG之後，不在最後一個(gè)exon上，最好能破壞重要的(de)domain和(hé)所有的(de)轉錄産物(wù)isoform。第一批合成3個(gè)，時(shí)間緊的(de)可(kě)一次上6個(gè)甚至9個(gè) | ||
選擇打靶載體 | 轉染效率低的(de)選擇帶熒光(guāng)或藥篩标記的(de)載體 | e-TALEN構建試劑盒、CAS9構建試劑盒 | |
内源活性初步驗證 | 轉染細胞，72h後提基因組，在靶點左右兩邊設計合适引物(wù)（建議(yì)一邊250bp，另外一邊150bp，也(yě)可(kě)以兩邊長(cháng)度相同）。分(fēn)兩組：突變型的(de)細胞和(hé)野生型細胞，PCR産物(wù)要單一，PCR産物(wù)的(de)長(cháng)度400-500bp。然後膠回收PCR産物(wù)，定量，分(fēn)别取等量的(de)突變型和(hé)野生型PCR産物(wù)自然退火雜(zá)交，用(yòng)T7E1酶切并跑膠檢測，如果野生型沒有雜(zá)帶，而突變型出現雜(zá)帶，則證明(míng)打靶質粒是有活性的(de)，突變比例可(kě)以通(tōng)過定量條帶亮度來(lái)估算(suàn)。 | ||
内源活性測序鑒定 | 将前面的(de)野生型和(hé)突變型PCR産物(wù)送測序，通(tōng)過測序圖譜來(lái)進一步确認是否發生突變，主要查看測序的(de)峰形圖，在靶點位置附近是否開始出現雜(zá)峰。 | ||
單克隆篩選 | 無限稀釋到每孔1個(gè)細胞的(de)數量，每株細胞鋪至少4個(gè)96孔闆。細胞長(cháng)好後，一部分(fēn)送去做(zuò)單克隆細胞的(de)基因型鑒定，剩下(xià)繼續擴大(dà)培養或者凍存。基因型鑒定參考内源活性初步驗證和(hé)測序鑒定的(de)方式。 | ||
獲得(de)突變型 | 擴增至10的(de)五次方，凍存多(duō)管 | ||
驗證數據
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