來(lái)自中科院生物(wù)物(wù)理(lǐ)所的(de)陳潤生、張樹利、駱健俊科研團隊在雜(zá)志 Cell Reports (IF=9.423) 上發表文章(zhāng)《Identification and characterization of long non-coding RNA Carip in modulating spatial learning and memory》。

長(cháng)期以來(lái) CaMKII 被認爲是突觸可(kě)塑性的(de)關鍵的(de)效應器。最近的(de)研究表明(míng)，多(duō)種調節劑可(kě)與 CaMKII 的(de)亞基相互作用(yòng)以調節海馬神經元的(de)長(cháng)時(shí)程增強效應(LTP)。然而，長(cháng)鏈非編碼 RNA 是否會調節 CaMKII 的(de)活性并影(yǐng)響突觸的(de)可(kě)塑性目前仍不清楚。在該研究中，研究人(rén)員(yuán)鑒定出了(le)一種以前未被表征過的(de)長(cháng)鏈非編碼 RNA， Carip， 它可(kě)以作爲一種支架來(lái)發揮作用(yòng)，與 CaMKIIβ 特異性來(lái)進行相互作用(yòng)，并調節海馬中 AMPA 和(hé) NMDA 受體亞基的(de)磷酸化(huà)。同時(shí) Carip 的(de)缺失會導緻突觸傳遞功能的(de)障礙并減弱海馬 CA3-CA1 突觸中的(de) LTP 作用(yòng)，從而導緻空間學習(xí)和(hé)記憶的(de)障礙。總而言之，研究人(rén)員(yuán)的(de)研究結果表明(míng) Carip 通(tōng)過改變 AMPA 受體和(hé) NMDA 受體的(de)活性來(lái)調節長(cháng)時(shí)程突觸的(de)可(kě)塑性，從而影(yǐng)響小鼠的(de)空間學習(xí)和(hé)記憶能力。

北(běi)京唯尚立德有幸爲該研究提供了(le) C57/BL WT mice， C57/BL Carip KO mice， C57/BL Carip Rescue mice 小鼠，爲能夠對(duì)科研人(rén)員(yuán)對(duì)腦(nǎo)科學的(de)研究提供一定的(de)助力唯尚深感榮幸。

爲了(le)系統的(de)探索 lncRNA 是否與 CaMKIIβ 的(de)功能相關，研究人(rén)員(yuán)首先通(tōng)過 RNA 免疫沉澱測序 (RIP-seq)， RIP-qPCR， WB， qPCR， FISH 等方法鑒定出了(le)一種與 CaMKIIβ 的(de)功能相關的(de) lncRNA 并将其稱之爲 Carip， 并通(tōng)過分(fēn)析顯示該 lncRNA 具有與蛋白質相互作用(yòng)的(de)能力，從而推斷 Carip 可(kě)能與海馬神經元中的(de) CaMKIIβ 有相互作用(yòng)。之後通(tōng)過 pull-down， EMSA 等實驗證明(míng) Carip 和(hé) CaMKIIβ 之間存在有特異性地結合。

爲了(le)評估 Carip 的(de)功能及其與 CaMKIIβ 的(de)交互作用(yòng)，通(tōng)過 CRISPR 方法構建了(le) Carip KO C57BL/6 小鼠，通(tōng)過對(duì) WT and Carip KO 小鼠的(de)海馬組織來(lái)進行 RNA-seq 分(fēn)析，結果顯示 Carip 對(duì)鈣離子具有潛在的(de)調節作用(yòng)。爲了(le)排除 CRISPR 的(de)非特異性作用(yòng)，又在 Carip KO 小鼠中敲入 Carip 來(lái)構建了(le) Carip Rescue C57BL/6 小鼠，通(tōng)過對(duì) WT， Carip KO and Carip Rescue 小鼠來(lái)進行 WB， HE 等實驗，結果顯示 Carip 的(de)敲除并不會影(yǐng)響 CaMKIIβ 的(de)表達，也(yě)不會損害海馬神經元的(de)發育，然而對(duì) Carip 的(de)敲除和(hé)恢複會影(yǐng)響 CaMKIIβ 下(xià)遊的(de) AMPAR and NMDAR 的(de)磷酸化(huà)水(shuǐ)平。

通(tōng)過在 WT and Carip KO 小鼠來(lái)進行 IP 等實驗，結果顯示在敲除 Carip 後會削弱 CaMKIIβ 與 GluA1 and GluA2 的(de)結合，從而推測 Carip 可(kě)能是穩定 CaMKIIβ 和(hé) AMPAR 的(de)支架，從而來(lái)調節海馬神經元中的(de) AMPAR 的(de)活性。

接下(xià)來(lái)，研究人(rén)員(yuán)研究了(le) Carip KO 是否會對(duì)海馬神經元間的(de)突觸傳遞和(hé) LTP 産生影(yǐng)響，通(tōng)過使用(yòng)電生理(lǐ)學等方法，結果顯示在 Carip KO 的(de)小鼠和(hé)細胞中微型興奮性突觸後電流 (mEPSC) 的(de)頻(pín)率不受影(yǐng)響，但幅度會略有下(xià)降，在 Carip Rescue 小鼠和(hé)細胞中 mEPSC 的(de)頻(pín)率與 WT and Carip KO 小鼠相似，但幅度會略有恢複。因此推斷 Carip 可(kě)能參與了(le)對(duì)突觸後神經傳遞的(de)調節。通(tōng)過對(duì) AMPAR-EPSCs 配對(duì)脈沖比(PPR 表示突觸前的(de)電強度)的(de)測量，發現在 WT， Carip KO and Carip Rescue 小鼠中 PPR 沒有顯著差異，從而表明(míng) Carip 調節的(de)是海馬神經元中的(de)突觸後的(de)傳遞而非突觸前的(de)傳遞。

由于 Carip KO 小鼠中的(de) NMDAR 的(de)磷酸化(huà)水(shuǐ)平降低，因此研究人(rén)員(yuán)進一步的(de)評估了(le) NMDAR 介導的(de) EPScs(NMDAR-EPSCs)，結果顯示，與 NMDAR 磷酸化(huà)的(de)減少一緻，在 Carip KO 小鼠中 NMDAR-EPSCs 的(de)振幅也(yě)被抑制。同樣的(de)，與 WT 小鼠相比，在 Carip KO 小鼠中 NMDAR 與 AMPAR 所介導的(de) EPSC 的(de)比率(NMDAR/AMPAR-EPSC)也(yě)發生了(le)顯著地降低，而在 Carip Rescue 小鼠中卻得(de)到了(le)逆轉。而突觸後的(de) AMPAR 和(hé) NMDAR 的(de)變化(huà)通(tōng)常會伴随著(zhe) LTP 的(de)變化(huà)，因此，研究人(rén)員(yuán)研究了(le)海馬 CA3-CA1 通(tōng)路中由刺激所誘導的(de) LTP 作用(yòng)，結果顯示 Carip KO 小鼠中的(de) LTP 雖然被誘導但卻顯著的(de)被減弱了(le)，而在 Carip Rescue 小鼠中卻得(de)到了(le)逆轉。因此，這(zhè)些結果表明(míng) Carip 會影(yǐng)響海馬中 AMPAR 和(hé)/或 NMDAR 所介導的(de)突觸後反應和(hé) LTP 作用(yòng)。

由于 LTP 是海馬突觸可(kě)塑性的(de)一種典型的(de)形式，被認爲與學習(xí)和(hé)記憶相關。因此，研究人(rén)員(yuán)對(duì) Carip KO 小鼠中 LTP 的(de)衰減是否會導緻空間學習(xí)和(hé)記憶的(de)障礙來(lái)進行了(le)研究。通(tōng)過使用(yòng) Morris 水(shuǐ)迷宮等行爲學實驗，研究發現在訓練期間，與 WT 小鼠相比 Carip KO 小鼠尋找平台的(de)時(shí)間就發生了(le)增加，而 Carip Rescue 小鼠的(de)表現與 WT 小鼠相似。在 24 小時(shí)以後，研究人(rén)員(yuán)移去平台以測試不同小鼠間的(de)空間記憶能力，與 WT and Carip Rescue 小鼠相比 Carip KO 在之前平台的(de)位置處表現出随機的(de)行爲。而 Carip Rescue 小鼠與 WT 小鼠的(de)表現相似。因此，數據表明(míng) Carip 在小鼠的(de)空間學習(xí)和(hé)記憶中起著(zhe)非常重要的(de)作用(yòng)。

本研究所用(yòng) C57/BL WT mice， C57/BL Carip KO mice， C57/BL Carip Rescue mice 小鼠均由北京天糧生物科技有限公司提供。本公司成立于 2011 年 3 月(yuè)，是由來(lái)自北(běi)京大(dà)學、中國醫學科學院的(de)科研團隊産業轉化(huà)而來(lái)的(de)國家高(gāo)新技術企業，也(yě)是國内第一家提供基因編輯技術服務的(de)公司，擁有豐富、成熟的(de)基因編輯動物(wù)構建經驗。此外，本公司也(yě)可(kě)提供動物(wù)繁育、動物(wù)實驗和(hé)數據分(fēn)析等一站式服務。爲廣大(dà)科研工作者的(de)科學研究工作保駕護航。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110398

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