山東大(dà)學張澄、張運和(hé)張猛老師的(de)課題組在 Science Translational Medicine 雜(zá)志上發表了(le)研究論文 “Erythropoietin promotes abdominal aortic aneurysms in mice through angiogenesis and inflammatory infiltration”，研究了(le)促紅細胞生成素(EPO)可(kě)能會促進腹主動脈瘤(AAA)形成的(de)猜想。研究發現，高(gāo)劑量的(de) EPO 可(kě)以同時(shí)促進 Apoe^-/-(66.7%) 敲除小鼠和(hé)野生型(WT)(60%)小鼠中的(de) AAA 的(de)形成，并且這(zhè)一過程是 EPO 劑量依賴性的(de)。使用(yòng) EPO 單克隆抗體來(lái)幹預接受血管緊張素 II(AngII) 刺激的(de) Apoe^-/- 小鼠，可(kě)以很明(míng)顯的(de)降低小鼠中 AAA 的(de)發生率(從 86.7% 到 20%, P<0.001)；同時(shí)，相較于 Apoe^-/- 敲除小鼠，通(tōng)過基因編輯的(de)手段被敲降 EPO 受體表達量的(de) Epor^+/-Apoe^-/- 小鼠，在被 AngII 刺激後 AAA 的(de)發生率被顯著的(de)降低了(le)(從 86.7% 到 45.5%, P<0.05)。這(zhè)兩點都進一步地支持了(le) EPO 對(duì) AAA 的(de)形成，具有非常顯著的(de)貢獻。該研究還(hái)表明(míng) EPO 誘導的(de) AAA 還(hái)導緻了(le)微血管的(de)增加、吞噬細胞的(de)浸潤和(hé)基質金屬蛋白酶的(de)分(fēn)泌的(de)增加，以及膠原蛋白和(hé)平滑肌細胞(SMC)的(de)減少等症狀。體内和(hé)體外的(de)實驗也(yě)表明(míng) EPO 是通(tōng)過 JAK2/STAT5 信号通(tōng)路來(lái)誘導内皮細胞的(de)增殖、遷移和(hé)微血管的(de)形成的(de)。臨床研究表明(míng)，在人(rén)類 AAA 患者的(de)血清中 EPO 的(de)濃度要明(míng)顯的(de)高(gāo)于健康人(rén)的(de)，并且與 AAA 的(de)大(dà)小顯著相關，這(zhè)表明(míng) EPO 的(de)濃度與人(rén)類 AAA 的(de)嚴重程度間存在有潛在的(de)聯系。總而言之，該研究表明(míng) EPO 不僅可(kě)以在 Apoe^-/- 敲除小鼠中，同時(shí)也(yě)可(kě)以在野生型的(de)小鼠中，通(tōng)過增強血管生成、炎症反應、膠原降解和(hé) SMC 凋亡等方式來(lái)促進 AAA 的(de)形成。并且 EPO/EPOR 信号通(tōng)路對(duì)于 AngII 誘導的(de) AAA 的(de)産生也(yě)是不可(kě)或缺的(de)。因此 EPO 對(duì)于 AAA 的(de)治療，具有非常重要的(de)臨床意義，然而 EPO 和(hé) AAA 在臨床上的(de)關聯，還(hái)需要再進行進一步的(de)研究。

簡介

腹主動脈瘤(AAA)是一種潛在可(kě)緻命的(de)血管類疾病，當腹主動脈局部發生擴張，直徑大(dà)于 3cm 或超過正常主動脈直徑的(de) 50% 即可(kě)被确認爲形成了(le)腹主動脈瘤。發生 AAA 的(de)患者通(tōng)常無症狀，直到主動脈發生破裂，死亡率爲 85% 至 90%。 盡管在探索 AAA 的(de)發病機制方面取得(de)了(le)進展，但尚無臨床生物(wù)标志物(wù)或藥物(wù)治療可(kě)有效的(de)降低 AAA 發展的(de)風險或限制其進展。

在多(duō)種 AAA 的(de)動物(wù)模型中，向 Apoe^-/- 敲除小鼠中注射血管緊張素 II(AngII) 是目前最常用(yòng)的(de)構建 AAA 模型的(de)方法，該模型表現出與人(rén)類在臨床中所發現的(de)比較一緻的(de)病理(lǐ)特征，包括炎症的(de)浸潤、細胞外基質(ECM)的(de)降解、血管生成、氧化(huà)應激和(hé)血栓形成等。先前的(de)臨床研究表明(míng)，接受過血管内修複術的(de) AAA 患者中有多(duō)達三分(fēn)之一的(de)患者患有貧血，并且低水(shuǐ)平的(de)循環血紅蛋白的(de)濃度與 AAA 的(de)大(dà)小顯著相關，盡管這(zhè)種關聯的(de)機制尚不清楚。最近的(de)一項研究表明(míng)，在 AngII 誘導的(de)高(gāo)脂血症小鼠中，抑制缺氧誘導因子 1α (HIF-1α) 可(kě)以減緩 AAA 的(de)進展。慢(màn)性貧血和(hé) HIF 可(kě)能會引發促紅細胞生成素(EPO)生成的(de)增加，最近也(yě)有證據表明(míng) AngII 可(kě)能是通(tōng)過直接刺激造血祖細胞的(de)受體或間接調節 EPO 基因的(de)表達來(lái)影(yǐng)響造血的(de)。據報道，有一個(gè)罕見的(de) AAA 的(de)病例，就是有一名接受慢(màn)性血液透析并反複接受高(gāo)劑量重組人(rén) EPO 的(de)患者所引發的(de)。這(zhè)些臨床和(hé)實驗研究都表明(míng) EPO 和(hé) AAA 之間存在著(zhe)一種未知的(de)聯系。

EPO 是調節紅細胞生成的(de)主要細胞因子，主要在胎兒(ér)的(de)肝髒和(hé)成人(rén)的(de)腎髒中生産。EPO 的(de)主要作用(yòng)是刺激紅細胞系統中的(de) EPO 受體(EPOR)并誘導紅細胞的(de)生成。最近的(de)研究發現 EPO 通(tōng)過在非造血組織中表達的(de) EPOR 也(yě)具有造血之外的(de)功能。例如 EPO 可(kě)以通(tōng)過促進内皮細胞(EC)的(de)增殖和(hé)遷移以及基質金屬蛋白酶 2(MMP2)的(de)産生來(lái)刺激新血管形成。盡管之前的(de)研究發現 EPO 可(kě)以通(tōng)過抑制心肌細胞的(de)凋亡和(hé)增強 ECs 産生 NO 的(de)功能來(lái)發揮保護心髒的(de)作用(yòng)，但最近的(de)一項 meta 分(fēn)析表明(míng) EPO 治療對(duì)心髒功能、梗死面積、心血管病變和(hé)急性心肌梗死患者的(de)死亡率沒有任何的(de)效果。此外，血清中高(gāo)濃度的(de) EPO 與心力衰竭的(de)風險增加有很明(míng)顯的(de)相關性。然而 EPO 和(hé) AAA 之間的(de)關系仍然未知，在該研究中，研究人(rén)員(yuán)對(duì) EPO 是否是通(tōng)過血管生成和(hé)炎症反應等方式來(lái)促進 AAA 的(de)形成的(de)假設來(lái)進行了(le)研究。

結果

1.EPO 以劑量依賴式的(de)方式可(kě)以同時(shí)在 Apoe^-/- 敲除小鼠和(hé)野生型小鼠中誘發 AAA 的(de)形成

對(duì) Apoe 敲除小鼠來(lái)進行 EPO 注射，随著(zhe)注射劑量的(de)增加，小鼠的(de)死亡率也(yě)增加(Fig.1A)；研究人(rén)員(yuán)首先檢查了(le) EPO 注射是否可(kě)以在喂食高(gāo)脂肪飲食(HFD)的(de) Apoe^-/- 小鼠中引發 AAA。EPO 處理(lǐ) 4 周後以劑量依賴性的(de)方式增加了(le) AAA 的(de)發生率(低劑量爲 26.7% 中劑量爲 40% 高(gāo)劑量爲 66.7%, Fig.1B)和(hé)腹主動脈的(de)直徑(Fig.1C)。四組 Apoe^-/- 敲除小鼠的(de)主動脈标本的(de)圖片如圖 Fig.1D 所示。與生理(lǐ)鹽水(shuǐ)處理(lǐ)的(de)對(duì)照(zhào)組相比 EPO 注射增加了(le)這(zhè)些小鼠中的(de)主動脈壁的(de)厚度并促進了(le)彈性層的(de)降解(Fig.1, E and F)。

Fig.1

對(duì)野生型小鼠來(lái)進行 EPO 注射，随著(zhe)注射劑量的(de)增加，小鼠的(de)死亡率也(yě)發生了(le)增加(Fig.2A)，與在 Apoe^-/- 小鼠中觀察到的(de)死亡率類似。研究人(rén)員(yuán)也(yě)檢查了(le) EPO 對(duì)膽固醇水(shuǐ)平正常的(de) WT 小鼠的(de)影(yǐng)響，結果顯示 EPO 注射 WT 小鼠 4 周後，也(yě)增加了(le) AAA 的(de)發生率和(hé)腹主動脈的(de)直徑(Fig.2, B and C)，特别是在高(gāo)劑量的(de) EPO 處理(lǐ)組的(de)小鼠中 AAA 的(de)發生率高(gāo)達 60% 而 AngII 誘導 AAA 的(de)發生率僅爲 13.3%。 四組 WT 小鼠的(de)主動脈标本的(de)圖片如圖 Fig.2D 所示。與使用(yòng)生理(lǐ)鹽水(shuǐ)處理(lǐ)的(de)對(duì)照(zhào)組相比 EPO 注射增加了(le)主動脈壁的(de)厚度，并且也(yě)促進了(le)彈性層的(de)降解(Fig.2, E and F)。

 Fig.2

2.血管生成有助于 EPO 在 Apoe^-/- 和(hé) WT 小鼠中來(lái)誘導 AAA 的(de)形成

由于與血管形态發生相關的(de)大(dà)部分(fēn)基因也(yě)參與了(le)血管的(de)生成，因此，研究人(rén)員(yuán)重點對(duì)對(duì)照(zhào)組和(hé)中等劑量 EPO 處理(lǐ)組小鼠中分(fēn)離出來(lái)的(de)主動脈來(lái)進行了(le)研究，檢測并評估了(le)這(zhè)些樣本中與血管生成相關的(de)基因和(hé)分(fēn)子。标記蛋白染色實驗的(de)結果顯示，相比于對(duì)照(zhào)組，中等劑量 EPO 處理(lǐ)組小鼠中的(de)微血管的(de)密度要更大(dà)(P<0.01; Fig.3, A and B)；通(tōng)過免疫組化(huà)和(hé) WB 的(de)實驗檢測，結果顯示中等劑量 EPO 處理(lǐ)組小鼠中的(de) MMP2, MMP9 and MT1-MMP 的(de)蛋白的(de)表達量都要明(míng)顯的(de)高(gāo)于對(duì)照(zhào)組(Fig.3, A to D)，并且通(tōng)過 zymography 實驗檢測，結果顯示出 MMP2 and MMP9 的(de)活性在實驗組和(hé)對(duì)照(zhào)組中也(yě)表現出了(le)類似的(de)變化(huà)(P<0.01 and P<0.01; Fig.3, E and F)。此外，在 Apoe^-/- 敲除小鼠中，相較于對(duì)照(zhào)組，中等劑量的(de) EPO 處理(lǐ)可(kě)以顯著的(de)減少平滑肌細胞(SMC)和(hé)膠原蛋白的(de)生成和(hé)累積(P<0.001 and P<0.001; Fig.3, A and B)，尤其是 I 型膠原蛋白(Col I)和(hé) III 型膠原蛋白(Col III)(P<0.05 and P<0.001; Fig.3, C and D)，這(zhè)表明(míng) EPO 處理(lǐ)誘導了(le) ECM 的(de)降解。由于 MMP 的(de)激活是血管生成的(de)關鍵步驟，所以研究人(rén)員(yuán)認爲增強的(de) MMP 活性可(kě)能有助于血管的(de)生成和(hé)加速 AAA 的(de)形成。研究人(rén)員(yuán)選擇了(le)幾個(gè)與血管生成相關的(de)候選基因，包括血管内皮生長(cháng)因子(VEGF)、轉化(huà)生長(cháng)因子-β1(TGF-β1)、激酶插入域蛋白受體(KDR)和(hé)酪氨酸蛋白激酶受體 Tie-2(Tie2)。 正如預期的(de)那樣，與對(duì)照(zhào)組相比，中等劑量的(de) EPO 處理(lǐ)顯著的(de)增加了(le)腹主動脈中 VEGF, TGF-β1, KDR and Tie2 蛋白量的(de)表達(P<0.05, P<0.01, P<0.05, and P<0.05, respectively; Fig.3, G and H)。

3.炎症反應有助于 EPO 在 Apoe^-/- 和(hé) WT 小鼠中來(lái)誘導 AAA 的(de)形成

研究人(rén)員(yuán)進一步研究了(le) EPO 處理(lǐ)是否會如 RNA-seq 分(fēn)析所表明(míng)的(de)那樣會加重炎症反應的(de)發生。通(tōng)過對(duì)主動脈壁的(de)組織病理(lǐ)學的(de)檢測，結果顯示，與對(duì)照(zhào)組相比，中等劑量的(de) EPO 的(de)處理(lǐ)促進了(le)吞噬細胞在主動脈壁中的(de)聚集以及促炎細胞因子在主動脈壁中的(de)表達，包括細胞間細胞粘附因子 1(ICAM-1)、血管細胞粘附因子 1(VCAM-1)、白細胞介素-6(IL-6)、IL-1β、單核細胞趨化(huà)蛋白 1(MCP-1)和(hé)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(Fig.3, I and J)。蛋白免疫印迹(WB)和(hé)定量 PCR(RT-PCR)分(fēn)析均顯示，中等劑量 EPO 處理(lǐ)小鼠動脈組織中的(de) CD68, ICAM-1, VCAM-1, IL-6, IL-1β, MCP-1 and TNF-α 基因的(de) mRNA 和(hé)蛋白的(de)表達量都要顯著的(de)高(gāo)于對(duì)照(zhào)組小鼠中的(de)(Fig.3, K to M)；此外，研究人(rén)員(yuán)還(hái)測量了(le)兩組小鼠的(de)血清中的(de)炎症因子的(de)濃度，發現與對(duì)照(zhào)組相比，中等劑量 EPO 處理(lǐ)組小鼠中的(de) IL-6, IL-1β, MCP-1 and TNF-α 的(de)含量都發生了(le)明(míng)顯的(de)增加(Fig.3N)。這(zhè)些數據都表明(míng)，動脈壁的(de)局部的(de)炎症和(hé)全身性的(de)炎症反應都參與了(le) EPO 所誘導的(de) AAA 的(de)形成。

Fig.3

4.EPO/EPOR 信号通(tōng)路對(duì)于 AngII 所誘導的(de) AAA 是至關重要的(de)

之後，研究人(rén)員(yuán)研究了(le) EPO 信号通(tōng)路在 AngII 所誘導的(de) AAA 的(de)小鼠模型中是否是必不可(kě)少的(de)。研究人(rén)員(yuán)在 Apoe^-/- 的(de)敲除小鼠中，注射了(le) AngII 與生理(lǐ)鹽水(shuǐ)分(fēn)别來(lái)構建 AAA 的(de)小鼠模型和(hé)對(duì)照(zhào)小鼠；同時(shí)，也(yě)在 2 組注射 EPO 的(de)小鼠中分(fēn)别來(lái)注射中和(hé) EPO 的(de)單克隆抗體(EPO mAb)和(hé)非特異性的(de)免疫球蛋白 G2a 來(lái)構建 EPO 中和(hé)和(hé)對(duì)照(zhào)的(de)小鼠模型，每周 3 次，連續 4 周。結果顯示 AngII 和(hé) AngII + IgG2a 組的(de) AAA 的(de)發生率分(fēn)别爲 80% 和(hé) 86.7%。 而在 AngII 處理(lǐ)後再用(yòng) EPO mAb 來(lái)進行幹預，則隻有 20% 的(de) AngII 輸注小鼠發展爲了(le) AAA(Fig.4A)。 對(duì)照(zhào)組、AngII、AngII+IgG2a 和(hé) AngII+EPO mAb 處理(lǐ)組的(de) Apoe^-/- 小鼠中的(de)代表性的(de)主動脈标本的(de)圖片如圖 Fig.4B 所示。此外，與 AngII+IgG2a 組相比 EPO mAb 的(de)幹預顯著的(de)降低了(le) AngII 所誘導的(de)死亡率(AngII+EPO mAb versus AngII+IgG2a, P<0.05; Fig.4C），并伴随有腹主動脈擴張的(de)減少(AngII+EPO mAb versus AngII+IgG2a, P<0.01; Fig.4D)。因此 EPO 是 AngII 和(hé) AAA 之間的(de)一個(gè)關鍵紐帶。

Fig.4

5.在 AngII 所誘導的(de) AAA 小鼠和(hé)患有 AAA 的(de)患者的(de)血清中 EPO 的(de)血清濃度都相對(duì)較高(gāo)

接下(xià)來(lái)研究人(rén)員(yuán)比較了(le)不同處理(lǐ)組的(de)小鼠血清中的(de) EPO 的(de)濃度。相較于對(duì)照(zhào)組，在 AngII 所誘導的(de) Apoe^-/- 和(hé) WT 小鼠的(de)血清中的(de)内源性的(de) EPO 濃度比對(duì)照(zhào)組要增加兩倍以上(P<0.001 和(hé) P<0.05)，這(zhè)表明(míng) AngII 處理(lǐ)可(kě)能會誘導 EPO 的(de)分(fēn)泌。此外 AngII 所誘導的(de) Apoe^-/- 敲除小鼠血清中的(de)内源性的(de) EPO 的(de)濃度要高(gāo)于 AngII 所誘導的(de) WT 小鼠(P<0.01)，這(zhè)可(kě)能也(yě)解釋了(le)前者的(de) AAA 的(de)發生率要高(gāo)于後者的(de)原因。

爲了(le)确定在人(rén)中 EPO 和(hé) AAA之間的(de)關系，研究人(rén)員(yuán)比較了(le) 136 例 AAA 患者和(hé) 92 個(gè)健康人(rén)的(de)血清中的(de) EPO 的(de)水(shuǐ)平。表 1 顯示了(le) AAA 患者和(hé)健康人(rén)的(de)臨床的(de)特征。結果顯示，與健康人(rén)相比 AAA 患者血清中的(de) EPO 的(de)濃度要顯著的(de)高(gāo)于健康人(rén)的(de)。此外，與健康人(rén)相比，患有 AAA 的(de)患者比較常見于具有以下(xià)一些特征的(de)人(rén)群中：年齡大(dà)、抽煙(yān)、高(gāo)血壓、糖尿病、高(gāo)血尿素氮和(hé)阿司匹林(lín)、stain、血管緊張素轉化(huà)酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體阻斷劑(ARB)、鈣通(tōng)道阻斷劑(CCB)的(de)使用(yòng)等。經過統計分(fēn)析，研究人(rén)員(yuán)進一步的(de)确認，隻有吸煙(yān)和(hé)血清 EPO 的(de)濃度是與 AAA 相關的(de)危險因素，并且也(yě)發現 AAA 患者的(de)腹主動脈的(de)直徑是與其血清中的(de) EPO 的(de)濃度是密切相關的(de)。

Table 1

6.在體外的(de)内皮細胞中 EPO 處理(lǐ)可(kě)以誘導細胞的(de)增殖、遷移、以及微管的(de)形成和(hé) MMP 的(de)分(fēn)泌

爲了(le)研究 EPO 誘導 AAA 的(de)基礎機制，研究人(rén)員(yuán)對(duì)含有在主動脈壁中所存在的(de)多(duō)種不同類型的(de)細胞的(de)原代培養細胞來(lái)進行了(le)研究。相比于平滑肌細胞和(hé)巨噬細胞 EPOR 在内皮細胞中的(de)表達量最高(gāo)(Fig.5A)，這(zhè)也(yě)表明(míng) EPO 可(kě)能是主要作用(yòng)于内皮細胞的(de)。之後，研究人(rén)員(yuán)研究了(le) EPO 對(duì)初級内皮細胞的(de)作用(yòng)(人(rén)臍靜脈内皮細胞 HUVECs 和(hé)人(rén)主動脈内皮細胞)，結果表明(míng)，與對(duì)照(zhào)組相比 EPO 的(de)處理(lǐ)促進了(le) EC 的(de)增殖(Fig.5, B and C)、遷移(Fig.5, D to G)和(hé)微管的(de)形成(Fig.5, H and I)。此外，相較于對(duì)照(zhào)組，在主動脈環中 EPO 能夠誘導 EC 的(de)萌發(Fig.5, J and K)。這(zhè)些結果都表明(míng) EPO 主要是直接作用(yòng)于 EC 并促進血管生成的(de)。

先前有研究報道 MMP 可(kě)以通(tōng)過降解 ECM 來(lái)促進 EC 的(de)侵入，從而來(lái)促進血管的(de)生成。因此，接下(xià)來(lái)研究人(rén)員(yuán)研究了(le)，在 EPO 刺激内皮細胞的(de)情況下(xià) MMP2, MMP9 and MT1-MMP 的(de)改變。結果顯示，相較于對(duì)照(zhào)組 MMP2, MMP9 and MT1-MMP 的(de)蛋白表達量，以及 MMP2 and MMP9 的(de)活性，在 EPO 刺激 24h 後都發生了(le)顯著的(de)增加(Fig.5, L to O)。因此 EPO 的(de)處理(lǐ)增強了(le) MMP 在 EC 中的(de)表達和(hé)活性。接下(xià)來(lái)，研究人(rén)員(yuán)檢測了(le)幾種與血管生成有關的(de)受體的(de)表達。正如預期的(de)那樣 KDR and Tie2 的(de)蛋白表達量相較于對(duì)照(zhào)組都發生了(le)明(míng)顯的(de)增加(Fig.5, L and M)。

Fig.5

7.EC 細胞對(duì)于 EPO 所誘導的(de)炎症反應、膠原降解以及 SMC 的(de)凋亡都是必不可(kě)少的(de)

首先，研究人(rén)員(yuán)證實了(le)與對(duì)照(zhào)組相比，中等劑量的(de) EPO 的(de)處理(lǐ)可(kě)以誘導吞噬細胞浸潤的(de)增加(Fig.3I)，然後，研究人(rén)員(yuán)在體外檢查了(le)巨噬細胞是如何參與 EPO 所誘導的(de)炎症反應的(de)。通(tōng)過 monocyte adhesion assay 實驗，結果顯示，與對(duì)照(zhào)組相比，僅用(yòng) EPO 刺激 24 小時(shí)即可(kě)導緻粘附在 HUVEC 上的(de)人(rén) THP-1 細胞的(de)數量增加了(le) 9 倍(P<0.001; Fig.6, A and B)，所以，單核細胞的(de)粘附可(kě)能會受 EPO 所影(yǐng)響的(de) HUVECs 的(de)趨化(huà)性和(hé)/或促炎作用(yòng)的(de)影(yǐng)響。爲了(le)區(qū)分(fēn)這(zhè)兩種效應，研究人(rén)員(yuán)用(yòng)單獨的(de) EPO 或用(yòng) EPO 預刺激的(de) HUVEC 培養基對(duì)巨噬細胞來(lái)進行了(le)處理(lǐ)，持續 24 小時(shí)(Fig.6C)。相較于體外的(de)基礎的(de)表達量，單獨的(de) EPO 的(de)處理(lǐ)并不會導緻巨噬細胞中的(de) IL-6, IL-1b, TNF-α and MCP-1 的(de) mRNA 的(de)表達量發生很明(míng)顯的(de)變化(huà)。然而，與基礎表達量相比，用(yòng) EPO 預處理(lǐ)的(de) HUVEC 培養基所處理(lǐ)的(de)巨噬細胞中，這(zhè)些炎性細胞因子的(de) mRNA 的(de)表達都得(de)到了(le)顯著的(de)增加(Fig.6D)。這(zhè)些結果表明(míng)，巨噬細胞中的(de)炎症反應是由 EPO 通(tōng)過 ECs 來(lái)進行誘導的(de)。

爲了(le)檢查 SMC 的(de)作用(yòng)，研究人(rén)員(yuán)僅用(yòng) EPO 對(duì) SMC 來(lái)進行了(le)處理(lǐ)，但未檢測到膠原蛋白和(hé) MMP 蛋白相對(duì)于基礎表達有很明(míng)顯的(de)變化(huà)。然而，與用(yòng)對(duì)照(zhào)組所預處理(lǐ)的(de) HUVEC 培養基來(lái)進行處理(lǐ)的(de) SMC 相比，用(yòng) EPO 預處理(lǐ)的(de) HUVEC 的(de)培養基來(lái)進行處理(lǐ)後的(de)細胞中的(de) Col I and Col III 的(de)表達發生了(le)顯著的(de)降低，但卻增加了(le) SMC 中的(de) MMP2 and MMP9 的(de)表達和(hé)活性(Fig.6, E to H)。因爲 Col I 和(hé) Col III 是 ECM 的(de)重要組成部分(fēn)，并且 MMP 也(yě)可(kě)以降解 ECM, 所以，這(zhè)些結果表明(míng) SMC 可(kě)能參與了(le) EPO 所誘導的(de) ECM 的(de)降解。接下(xià)來(lái)，研究人(rén)員(yuán)研究了(le) EPO 是否會影(yǐng)響到 SMC 細胞的(de)凋亡和(hé)增殖，發現單獨的(de) EPO 并不會改變 SMC 細胞的(de)凋亡或增殖，而用(yòng) EPO 預處理(lǐ)的(de) HUVEC 的(de)培養基卻增加了(le) SMC 細胞的(de)凋亡并減少了(le)增殖(Fig.6, I to N)。這(zhè)些結果表明(míng) EPO 是通(tōng)過 ECs 來(lái)誘導 SMC 的(de)凋亡的(de)。

Fig.6

8.EPO 可(kě)以在離體組織中促進血管的(de)生成和(hé)吞噬細胞的(de)浸潤

爲了(le)進一步闡明(míng) EPO 是否可(kě)以促進血管的(de)生成和(hé)炎症反應，研究人(rén)員(yuán)将含有或不含 EPO (50 IU/ml) 的(de) Matrigel plugs 皮下(xià)注射到 WT 小鼠中。注射兩周後，将 Matrigel plugs 切除下(xià)來(lái)，并用(yòng)福爾馬林(lín)固定包埋。不含 EPO 的(de) Matrigel plugs 呈黃(huáng)色，但含有 EPO 的(de) Matrigel plugs 呈紅色(Fig.7A)，這(zhè)表明(míng) Matrigel plugs 内形成了(le)血管。組織學檢測顯示，與對(duì)照(zhào)組相比，含有 EPO 的(de) Matrigel plugs 中的(de)侵入細胞和(hé)血管的(de)數量都發生了(le)增加(Fig.7B)，這(zhè)表明(míng) EPO 促進了(le)細胞的(de)遷移和(hé)新血管的(de)形成。随後，研究人(rén)員(yuán)用(yòng) CD144(一種 EC 标記) 和(hé) Ki67(增殖标記) 對(duì) Matrigel plugs 切片來(lái)進行了(le)雙重的(de)免疫染色，以顯示出增殖細胞群。結果顯示含有 EPO 的(de) Matrigel plugs 中的(de) Ki67⁺ 增殖的(de) EC 的(de)數量要明(míng)顯的(de)高(gāo)于對(duì)照(zhào)組中的(de)(P<0.001; Fig.7, C and D)，這(zhè)表明(míng) EPO 促進了(le) EC 的(de)增殖和(hé)遷移。此外，在含有 EPO 的(de) Matrigel plugs 中的(de) CD68, IL-6, IL-1β, MCP-1 and TNF-α 蛋白的(de)表達量也(yě)要顯著的(de)高(gāo)于對(duì)照(zhào)組中的(de)(Fig.7, E and F)，這(zhè)表明(míng) EPO 促進了(le)吞噬細胞的(de)侵襲并增強了(le)炎症因子的(de)分(fēn)泌。

9.JAK2/STAT5 信号通(tōng)路介導了(le) EPO 所誘導的(de)血管生成

通(tōng)過對(duì) EPO 和(hé)對(duì)照(zhào)所誘導的(de)主動脈組織的(de) RNA-seq 的(de)結果顯示，在 EPO 處理(lǐ)組中與 JAK/STAT 通(tōng)路相關的(de)基因發生了(le)顯著的(de)改變。因此，研究人(rén)員(yuán)又在 HUVEC 中對(duì) JAK2/STAT5 通(tōng)路是否參與 EPO 所誘導的(de)血管生成來(lái)進行了(le)檢測。結果顯示，在 HUVEC 細胞中 EPO 處理(lǐ)組中的(de) JAK2 and STAT5 的(de)磷酸化(huà)的(de)水(shuǐ)平要明(míng)顯的(de)高(gāo)于對(duì)照(zhào)組(Fig.7, G and H)，這(zhè)表明(míng) EPO 激活了(le) JAK2/STAT5 信号通(tōng)路。之後，研究人(rén)員(yuán)在 HUVEC 細胞中使用(yòng) TG101348(一種 JAK2 選擇性的(de)抑制劑) and CAS 285986-31-4(一種 STAT5 抑制劑)來(lái)抑制該信号通(tōng)路，發現 EPO 處理(lǐ)後的(de) JAK2 and STAT5 的(de)磷酸化(huà)水(shuǐ)平相較于對(duì)照(zhào)組發生了(le)顯著的(de)下(xià)降(Fig.7, G and H)。在微管形成的(de)實驗中，用(yòng) JAK2 抑制劑或 STAT5 抑制劑來(lái)處理(lǐ)細胞，結果顯示 EPO 對(duì) HUVEC 的(de)促血管生成作用(yòng)被消除了(le)(Fig.7, I and J)。因此，結果表明(míng) EPO 主要是通(tōng)過 ECs 中的(de) JAK2/STAT5 通(tōng)路來(lái)誘導血管生成的(de)。

Fig.7

討(tǎo)論

該研究發現 EPO 可(kě)以以劑量依賴性地方式來(lái)促進 AAA 的(de)形成，在接受高(gāo)劑量的(de) EPO 所誘導的(de) Apoe^-/- 和(hé)野生型(WT)小鼠中的(de) AAA 的(de)形成率分(fēn)别爲 66.7% and 60%。 而對(duì) AngII 所處理(lǐ)的(de) Apoe^-/- 小鼠再給予 EPO 單克隆抗體的(de)處理(lǐ)，可(kě)以導緻 AAA 的(de)發生率發生顯著的(de)降低(從 86.7% 到 20%, P<0.001)。同樣的(de)，與 Apoe^-/- 小鼠相比，使用(yòng) AngII 來(lái)誘導 EPO 受體(EPOR)敲低 Epor^+/-Apoe^-/- 的(de)小鼠 AAA 的(de)發生率也(yě)發生了(le)顯著的(de)降低(從 86.7% 到 45.5%, P<0.05)。以上結果都表明(míng) EPO 是導緻 AAA 形成的(de)重要影(yǐng)響因素。

EPO 在誘導 AAA 形成的(de)同時(shí)，也(yě)會伴随有微血管的(de)增加、吞噬細胞的(de)浸潤和(hé)基質金屬蛋白酶的(de)增加，以及膠原蛋白和(hé)平滑肌細胞(SMC)的(de)減少。體外和(hé)離體的(de)實驗結果都表明(míng) EPO 可(kě)以通(tōng)過 JAK2/STAT5 信号通(tōng)路來(lái)誘導内皮細胞的(de)增殖、遷移和(hé)微管的(de)形成。同時(shí)，在人(rén)類中 AAA 患者的(de)血清中的(de) EPO 的(de)濃度要明(míng)顯的(de)高(gāo)于健康的(de)人(rén)，并且與 AAA 的(de)大(dà)小密切相關，這(zhè)表明(míng) EPO 與人(rén)類 AAA 的(de)嚴重程度之間存在有潛在聯系。

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