由于心髒纖維化(huà)是 DCM 的(de)一個(gè)顯著特征，因此，研究人(rén)員(yuán)在體内實驗中(WT+對(duì)照(zhào)、NPRC−/−+對(duì)照(zhào)、WT+DM 和(hé) NPRC−/−+DM)中檢測了(le)心肌纖維化(huà)的(de)程度。使用(yòng) Masson 染色顯示，在’WT+對(duì)照(zhào)組’和(hé)’NPRC−/−+對(duì)照(zhào)組’的(de)小鼠中很少表現出心肌纖維化(huà)。與’NPRC−/−+DM’小鼠相比，糖尿病增加了(le)’WT+DM’小鼠心髒血管周圍和(hé)間質空間的(de)膠原積聚。通(tōng)過免疫組化(huà)(IHC)分(fēn)析 I 型膠原和(hé) III 型膠原，結果顯示’WT+DM 組’的(de)膠原表達高(gāo)于’NPRC−/−+DM 組’。蛋白免疫印迹(WB)在四組小鼠中也(yě)顯示出了(le)相似的(de)膠原表達變化(huà)(圖 3)。這(zhè)些發現表明(míng) NPRC 缺失在體内減輕了(le)糖尿病心髒的(de)心髒纖維化(huà)。研究人(rén)員(yuán)還(hái)檢測了(le)四組小鼠左心房(fáng)的(de)纖維化(huà)程度。使用(yòng) Masson 染色和(hé)針對(duì) I 型膠原和(hé) III 型膠原的(de) IHC 來(lái)進行分(fēn)析，結果顯示’WT+對(duì)照(zhào)組’和(hé)’NPRC−/−+對(duì)照(zhào)組’的(de)小鼠顯示出相似程度的(de)左心房(fáng)纖維化(huà)，而’NPRC−/−+DM 組’的(de)小鼠相對(duì)于’WT+DM 組’顯示出左心房(fáng)膠原積聚的(de)減少，這(zhè)與左心室的(de)變化(huà)相似。

圖3

TGF-β1 是一種與纖維化(huà)進展有關的(de)關鍵促纖維化(huà)細胞因子，并且它與經典 Smad 信号通(tōng)路相關。因此，研究人(rén)員(yuán)使用(yòng) WB 檢測了(le) TGF-β1/Smad 信号通(tōng)路中相關介質的(de)表達水(shuǐ)平。結果顯示，與’WT+DM 組’相比，’NPRC−/−+DM 組’中 TGF-β1, p-Smad2 和(hé) p-Smad3 的(de)表達水(shuǐ)平都降低，表明(míng) NPRC 缺失抑制了(le) TGF-β1/Smad 信号通(tōng)路的(de)激活(圖 3)。

由于 NPRC 通(tōng)過其細胞内結構域參與 cAMP/PKA 信号通(tōng)路的(de)抑制和(hé)循環 NPs 的(de)清除，研究人(rén)員(yuán)認爲 NPRC 缺失可(kě)能影(yǐng)響了(le)細胞内 cAMP/PKA 信号通(tōng)路和(hé)細胞外 NPs 的(de)清除。爲了(le)驗證這(zhè)一假設，研究人(rén)員(yuán)分(fēn)兩部分(fēn)進行了(le)體外實驗。在第一部分(fēn)中，通(tōng)過将 si-NPRC 轉染到 NRCF 和(hé) hiPSC CF 中來(lái)降低 NPRC 蛋白表達，然後用(yòng) NG(5.5mM)或 HG(33.3mM)處理(lǐ)細胞 72 小時(shí)。在第二部分(fēn)中，考慮到 NPs 不僅由 CF 表達和(hé)分(fēn)泌，而且由 CM 表達和(hé)分(fēn)泌。在 HG 刺激下(xià)，在 CM 中 NPRC 的(de)表達增加，研究人(rén)員(yuán)首先通(tōng)過在 NRCM 和(hé) hiPSC CM 中轉染 si-NPRC 來(lái)降低 NPRC 的(de)蛋白表達，然後 NG 或 HG 刺激 48 小時(shí)。随後，用(yòng) NRCM 上清液處理(lǐ) NRCF 而用(yòng) hiPSC CM 上清液處理(lǐ) hiPSC CF 72 小時(shí)。

圖4

如前所述 TGF-β1/Smad 信号通(tōng)路在 CF 膠原合成和(hé)增殖的(de)調節中起著(zhe)至關重要的(de)作用(yòng)。因此，研究人(rén)員(yuán)評估了(le) NRCF 的(de) TGF-β1/Smad 信号通(tōng)路的(de)變化(huà)。實驗 WB 的(de)結果顯示，在 si-NC+HG 組中 HG 處理(lǐ)增加了(le) TGF-β1 的(de)蛋白表達以及 Smad2 and Smad3 的(de)磷酸化(huà)(p-Smad2 and p-Smad3)，而在 si-NPRC+HG 組中 NPRC 敲低則逆轉了(le)這(zhè)一現象。相反 TGF-βR2 的(de)蛋白表達沒有表現出顯著變化(huà)。這(zhè)些結果表明(míng) NRCF 中 NPRC 的(de)敲低降低了(le) TGF-β1 的(de)表達和(hé) Smad2/3 的(de)磷酸化(huà)，導緻膠原合成和(hé)增殖受到抑制。通(tōng)過 WB 在 hiPSC CF 中觀察到了(le)類似的(de)結果。

在第二部分(fēn)中，與 si-NC+HG 組相比，在 si-NPRC+HG 組中用(yòng) NRCM 上清液處理(lǐ) NRCF 顯著降低了(le) I 型膠原和(hé) III 型膠原的(de)蛋白質表達。在用(yòng) hiPSC CM 上清液處理(lǐ)的(de) hiPSC CF 中觀察到了(le)類似的(de)結果。使用(yòng) EDU 和(hé) CCK-8 測定還(hái)表明(míng)，與 si-NC+HG 組相比，用(yòng)來(lái)自 si-NPRC+HG 組的(de) NRCM 和(hé) hiPSC CM 上清液處理(lǐ)可(kě)顯著抑制 NRCF 和(hé) hiPSC CF 的(de)增殖。通(tōng)過 WB 測定顯示 PCNA 的(de)蛋白表達顯示出類似的(de)變化(huà)(圖 5)。蛋白免疫印迹還(hái)檢測了(le) TGF-β1/Smad 信号通(tōng)路的(de)變化(huà)，表明(míng)用(yòng) NPRC 缺失的(de) NRCM 上清液來(lái)處理(lǐ)，因子 TGF-β1 的(de)表達沒有改變。然而，在用(yòng)來(lái)自 si-NPRC+HG 組的(de) NRCM 上清液處理(lǐ)的(de) NRCF 中 p-Smad2 and p-Smad3 的(de)表達仍然低于用(yòng)來(lái)自 si-NC+HG 組上清液處理(lǐ)的(de)組。通(tōng)過蛋白質印迹在用(yòng) hiPSC CM 上清液處理(lǐ)的(de) hiPSC CF 中觀察到了(le)類似的(de)結果。這(zhè)些結果表明(míng)，調節 TGF-β1/Smad 信号通(tōng)路的(de)機制在 NPRC 缺失的(de) CF 中和(hé)在用(yòng) NPRC 缺失 CM 上清液處理(lǐ)的(de) CF 中是可(kě)能不同的(de)。

圖5

5、NPRC 缺失抑制了(le)心髒成纖維細胞(CF)的(de)膠原合成和(hé)增殖

爲了(le)進一步探索 NPRC 對(duì)膠原合成和(hé)增殖作用(yòng)的(de)調節機制，研究人(rén)員(yuán)使用(yòng) NRCF 進行了(le)轉錄組 RNA 測序。基因表達譜在各組内的(de)樣品中具有高(gāo)度可(kě)重複性。基因本體論(GO)富集顯示，在 NRCF 的(de) si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組之間表現出顯著差異的(de)前 10 個(gè)生物(wù)過程中，主要涉及的(de)是染色體分(fēn)離和(hé)細胞周期的(de)過程。這(zhè)一發現與上述結果一緻，即與 si-NC+NG 組相比 si-NC+HG 組 NRCF 的(de)增殖增加。此外，研究人(rén)員(yuán)發現，将 si-NC+HG 和(hé) si-NPRC+HG 組進行比較，對(duì)有機物(wù)的(de)反應、信号轉導的(de)調節和(hé)細胞增殖是被影(yǐng)響最大(dà)的(de)生物(wù)過程。然後，研究人(rén)員(yuán)選擇了(le)在這(zhè)些過程中最頻(pín)繁重複的(de) 24 個(gè)上調和(hé) 16 個(gè)下(xià)調基因來(lái)進行研究。在這(zhè)些基因中，研究人(rén)員(yuán)重點研究了(le)與纖維化(huà)相關的(de) 7 個(gè)上調和(hé) 2 個(gè)下(xià)調基因，通(tōng)過分(fēn)析它們在 NRCF 中的(de)表達水(shuǐ)平和(hé)倍數變化(huà)，研究人(rén)員(yuán)最終選擇 Tgif1 來(lái)進行進一步的(de)研究。

Tgif1 負責編碼 TGIF1 蛋白，該蛋白通(tōng)過多(duō)種機制來(lái)發揮 TGF-β 信号傳導的(de)核共抑制因子的(de)作用(yòng)，包括募集轉錄抑制複合物(wù)來(lái)抑制 TGF-β 的(de)轉錄，促進 Smad2 的(de)泛素依賴性蛋白酶體的(de)降解，以及将 cPML 隔離在細胞核中以防止其穿梭到細胞質從而在細胞質中促進 Smad2/3 的(de)磷酸化(huà)。研究人(rén)員(yuán)發現，在體外實驗的(de)第一部分(fēn)，在 NG 和(hé) HG 處理(lǐ)中 NPRC 敲低增加了(le) NRCF 中 tgif1 的(de) mRNA 水(shuǐ)平(圖 6, si-NC + NG versus si-NPRC + NG, and si-NC + HG versus si-NPRC + HG, all P < 0.001)。同樣 NPRC 敲低增加了(le) tgif1 在 NRCF 和(hé) hiPSC CF 中的(de)蛋白表達(圖 6)。在體外實驗的(de)第二部分(fēn)中，用(yòng)來(lái)自 si-NPRC+NG 或 si-NPRC+HG 組的(de) NRCM 和(hé) hiPSC CM 上清液處理(lǐ)增加了(le) NRCF 和(hé) hiPSC CF 中 TGIF1 的(de)蛋白表達(圖 6)。相對(duì)于’WT+對(duì)照(zhào)’和(hé)’WT+DM 組’，在’NPRC−/−+對(duì)照(zhào)’和(hé)’NPRC−/−+DM’組的(de)小鼠中 TGIF1 蛋白的(de)表達也(yě)分(fēn)别增加(圖 6)。

圖6

爲了(le)進一步研究表達增加的(de) TGIF1 在 CF 中抑制 TGF-β1/Smad 信号通(tōng)路的(de)機制，研究人(rén)員(yuán)用(yòng) siRNA (si-TGIF1) 轉染 NRCF 以降低 TGIF1 在 NRCF 中的(de)表達。蛋白免疫印迹顯示 TGIF1 敲降後 I 型膠原和(hé) III 型膠原的(de)蛋白質表達顯著增加。蛋白 Smad2 and Smad3 的(de)表達沒有顯著變化(huà)，但 TGIF1 敲降後 p-Smad2 和(hé) p-Smad3 水(shuǐ)平顯著增加。這(zhè)些結果表明(míng) TGIF1 通(tōng)過減弱 Smad2 和(hé) Smad3 磷酸化(huà)而不是降解 Smad2 和(hé) Smad3 本身來(lái)抑制 NRCF 中的(de) TGF-β1/Smad 信号傳導。

已有研究表明(míng) cPML 是一種在細胞核和(hé)細胞質之間穿梭以促進 Smad2/3 磷酸化(huà)的(de)關鍵蛋白。爲了(le)探討(tǎo) NRCF 中 NPRC 的(de)敲除是否與 cPML 定位的(de)變化(huà)有關，研究人(rén)員(yuán)進行了(le)免疫熒光(guāng)染色，結果表明(míng)，與 si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組相比 si-NPRC + NG 和(hé) si-NPRC + HG 分(fēn)别顯著增強了(le) cPML 的(de)核定位。此外，研究人(rén)員(yuán)分(fēn)離了(le)細胞核和(hé)細胞質蛋白，發現 si-NPRC+NG 和(hé) si-NPRC+HG 組的(de)細胞核和(hé)細胞質 cPML 表達水(shuǐ)平的(de)比率(nuclear/cytoplasmic)分(fēn)别顯著高(gāo)于 si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組。此外，免疫共沉澱分(fēn)析顯示 NRCF 中 NPRC 的(de)敲低導緻了(le) cPML 與 TGIF1 的(de)結合增加(圖 6)。

爲了(le)進一步研究 TGIF1 是否介導了(le) NPRC 對(duì)膠原合成的(de)影(yǐng)響，研究人(rén)員(yuán)通(tōng)過轉染 siRNA 來(lái)同時(shí)敲降 NPRC 和(hé) TGIF1 如體外實驗的(de)第三部分(fēn)所述。與用(yòng) si-NC 轉染的(de) NRCF 相比 si-NPRC 轉染降低了(le) I 型膠原和(hé) III 型膠原的(de)蛋白表達，并增加了(le) TGIF1 的(de)蛋白表達。然而，當升高(gāo)的(de) TGIF1 水(shuǐ)平被 si-TGIF1 敲低時(shí)，在 si-NPRC+si-TGIF 組中 I 型膠原和(hé) III 型膠原的(de)蛋白質表達部分(fēn)被逆轉(圖 6)。在 hiPSC CF 中觀察到了(le)類似的(de)結果。這(zhè)些結果表明(míng) TGIF1 在 CF 細胞中的(de) NPRC 缺乏調節 TGF-β1/Smad 信号傳導以及膠原合成和(hé)增殖的(de)機制中起著(zhe)至關重要的(de)作用(yòng)。

上述結果證實 NPRC 通(tōng)過 TGIF1 參與 TGF-β1/Smad 信号傳導的(de)調節，但 NPRC 缺失增加 TGIF1 表達的(de)機制仍有待闡明(míng)。如前所述 NPRC 不僅作爲 ANP, BNP 和(hé) CNP 的(de)清除受體，而且其在細胞内的(de)部分(fēn)具有 Gi 的(de)結合結構域，可(kě)以抑制 AC 活性并降低細胞内 cAMP 的(de)水(shuǐ)平。爲了(le)探索 NPRC 缺失對(duì) cAMP 水(shuǐ)平的(de)影(yǐng)響，研究人(rén)員(yuán)首先在體外實驗的(de)第一部分(fēn)中檢測了(le) NRCF 的(de)細胞内 cAMP 水(shuǐ)平，并發現 si-NPRC + HG 組的(de)細胞内 cAMP 水(shuǐ)平顯著高(gāo)于 si-NC+HG 組。此外，研究人(rén)員(yuán)通(tōng)過測量 PKA 底物(wù)(RRXS*/T*)和(hé) cAMP 反應元件結合蛋白(CREB)的(de)磷酸化(huà)水(shuǐ)平來(lái)研究細胞内 PKA 活性。與 cAMP 水(shuǐ)平的(de)變化(huà)一緻，與 si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組相比 si-NPRC + NG and si-NPRC + HG 組的(de) p-PKA 底物(wù)和(hé) p-CREB 的(de)蛋白表達分(fēn)别增加。研究人(rén)員(yuán)還(hái)檢測了(le) p-PKA 底物(wù)和(hé) p-CREB 在 hiPSC CF 中的(de)表達，并發現與 si-NC 轉染組相比 si-NPRC 轉染組的(de) p-PKA 底物(wù)和(hé) p-CREB 水(shuǐ)平增加。特别的(de)，通(tōng)過 WB and IHC檢測發現，相對(duì)于’WT+對(duì)照(zhào)組’和(hé)’WT+DM 組’，’NPRC−/−+對(duì)照(zhào)’和(hé)’NPRC−/−+DM 組’的(de)小鼠分(fēn)别表現出 p-PKA 底物(wù)和(hé) p-CREB 的(de)蛋白表達增加(圖 7)。

圖7

IHC and WB 顯示，與’WT+對(duì)照(zhào)’和(hé)’WT+DM 組’相比，’NPRC−/−+對(duì)照(zhào)’和(hé)’NPRC−/−+DM 組’中 VASP 的(de)磷酸化(huà)水(shuǐ)平分(fēn)别增加，這(zhè)是 cGMP/PKG 激活的(de)指标，表明(míng) cGMP/PKG 信号通(tōng)路在 NPRC KO 小鼠中被激活(圖 8)。

圖8

由于 NPRC 負責體内 ANP, BNP 和(hé) CNP 的(de)清除，研究人(rén)員(yuán)認爲 NPRC KO 小鼠中激活的(de) cGMP/PKG 信号可(kě)能是由于 NPRC 降解 NPs 的(de)能力減弱所引起的(de)。爲了(le)驗證這(zhè)一假設，研究人(rén)員(yuán)通(tōng)過 IHC 測量了(le)患有或不患 DM 的(de) WT 和(hé) NPRC KO 小鼠心髒中 ANP, BNP 和(hé) CNP 的(de)蛋白表達水(shuǐ)平。結果顯示，與’WT+對(duì)照(zhào)組’和(hé)’WT+DM 組’相比，’NPRC−/−+對(duì)照(zhào)組’的(de)小鼠和(hé)’NPRC−/−+DM 組’的(de)小鼠心髒組織中 ANP, BNP 和(hé) CNP 水(shuǐ)平分(fēn)别升高(gāo)。此外，與’WT+對(duì)照(zhào)組’和(hé)’WT+DM 組’相比，’NPRC−/−+對(duì)照(zhào)’和(hé)’NPRC−/−+DM 組’的(de) ANP 和(hé) CNP 血清水(shuǐ)平分(fēn)别升高(gāo)。另一方面，盡管 WT+DM 組的(de) BNP 血清水(shuǐ)平高(gāo)于 WT+對(duì)照(zhào)組，但 NPRC 缺失并未顯著影(yǐng)響 BNP 的(de)血清水(shuǐ)平，這(zhè)可(kě)能是由于血清 BNP 水(shuǐ)平相當的(de)低，在 WT+對(duì)照(zhào)組中敲除 NPRC 并不顯著增加。相反，由于心髒功能障礙 WT+DM 組的(de)血清 BNP 水(shuǐ)平顯著升高(gāo)，這(zhè)可(kě)能掩蓋了(le)該組小鼠 NPRC 缺失的(de)影(yǐng)響。正如預期的(de)那樣，四組小鼠中 GCA 和(hé) GCB 的(de)蛋白表達水(shuǐ)平沒有顯著差異(圖 8)。這(zhè)些結果表明(míng)，體内 NPRC 缺失導緻血清 NPs 水(shuǐ)平升高(gāo)和(hé)心髒局部 NPs 表達升高(gāo)，從而通(tōng)過未受影(yǐng)響的(de) GCA 和(hé) GCB 來(lái)激活細胞内 cGMP/PKG 信号的(de)傳導。

此外，研究人(rén)員(yuán)在體外實驗的(de)第一部分(fēn)中檢測了(le)細胞内 cGMP/PKG 的(de)活性，并發現 si-NPRC + NG and si-NPRC + HG 組 NRCF 細胞内 cGMP 的(de)水(shuǐ)平分(fēn)别顯著高(gāo)于 si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組。同樣的(de)，與 si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組相比 si-NPRC + NG and si-NPRC + HG 組中 p-VASP 的(de)表達分(fēn)别增加。沒有觀察到 GCA 和(hé) GCB 的(de)表達有顯著差異(圖 8)。由于 CFs 能夠分(fēn)泌 NPs 研究人(rén)員(yuán)檢測了(le) NRCF 上清液中 NP 的(de)水(shuǐ)平，發現與 si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組相比 si-NPRC + NG and si-NPRC + HG 組中的(de)三種 NPs 均分(fēn)别增加。在 hiPSC CF 中觀察到了(le)類似的(de)結果，即與 si-NC+NG 和(hé) si-NC+HG 組相比 si-NPRC + NG and si-NPRC + HG 組的(de) p-VASP 水(shuǐ)平分(fēn)别增加。

此後，研究人(rén)員(yuán)在體外實驗的(de)第二部分(fēn)中檢測了(le) NRCF 中 cGMP 和(hé) p-VASP 的(de)細胞内水(shuǐ)平。用(yòng)來(lái)自 si-NPRC+NG 或 si-NPRC+HG 組的(de) NRCM 上清液處理(lǐ)增加了(le) NRCF 中 cGMP 的(de)細胞内水(shuǐ)平和(hé) p-VASP 的(de)蛋白水(shuǐ)平(圖 8)，這(zhè)可(kě)能是因爲 NRCM 上清液中 NP 水(shuǐ)平的(de)升高(gāo)。在 hiPSC CF 中觀察到了(le)類似的(de)結果，即用(yòng)來(lái)自 si-NPRC 轉染組的(de) hiPSC CM 上清液處理(lǐ)增加了(le) p-VASP 的(de)表達。這(zhè)些結果表明(míng)，由于 NPs 水(shuǐ)平升高(gāo) cGMP/PKG 信号在 NPRC KO 小鼠中被激活。此外，在 NPRC 缺陷的(de) CF 中 cGMP/PKG 信号也(yě)被升高(gāo)的(de) NPs 以自分(fēn)泌方式激活。此外，在用(yòng) CM 上清液處理(lǐ)的(de) CF 中，在 CM 中 NPRC 的(de)缺失也(yě)以旁分(fēn)泌的(de)方式激活了(le) CF 中 cGMP/PKG 的(de)信号傳導，表明(míng)存在有 CM-CF 串擾。來(lái)自 WT+DM 和(hé) NPRC−/−+DM 小鼠 MCFs 的(de) WB 顯示，在源自 NPRC 缺陷的(de)糖尿病小鼠的(de) CF 中 p-PKA, p-CREB 和(hé) p-VASP 的(de)水(shuǐ)平增加，這(zhè)表明(míng) NPRC 缺失激活了(le)糖尿病條件下(xià) CF 中 cAMP/PKA 和(hé) cGMP/PKG 的(de)信号傳導。

爲了(le)比較 ANP, BNP 和(hé) CNP 輸注與 NPRC 敲除對(duì)糖尿病心髒纖維化(huà)的(de)保護作用(yòng)，研究人(rén)員(yuán)進行了(le)體内實驗，在該實驗中，糖尿病 WT 小鼠接受 ANP, BN 或 CNP 輸注，并将 ANP, BNP 和(hé) CNP 的(de)作用(yòng)與糖尿病 NPRC−/− 小鼠的(de)作用(yòng)進行了(le)比較。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)顯示，與 DM+生理(lǐ)鹽水(shuǐ)組相比 DM+ANP, DM+BNP 和(hé) DM+CNP 輸注組的(de)血清 ANP, BNP 和(hé) CNP 水(shuǐ)平分(fēn)别顯著升高(gāo)，證明(míng)了(le) NPs 輸注的(de)療效。相比之下(xià) DM+NPRC−/− 組的(de) ANP, BNP 和(hé) CNP 的(de)血清水(shuǐ)平也(yě)比 DM+生理(lǐ)鹽水(shuǐ)組升高(gāo)，與 DM+ANP, DM+BNP 或 DM+CNP 輸注組相似。盡管 ANP, BNP 和(hé) CNP 輸注以及 NPRC 缺失均降低了(le)心肌的(de)膠原積聚，但 NPRC−/− 小鼠在四個(gè)治療組中表現出最爲顯著的(de)改善。結果表明(míng) NPRC 缺失表現出比外源性 NPs 輸注更有效的(de)心髒保護作用(yòng)。這(zhè)種有趣的(de)效果可(kě)能是由于 NPRC 缺失同時(shí)激活了(le) cAMP/PKA 和(hé) cGMP/PKG 途徑，而 NPs 僅激活 cGMP/PK 途徑，從而通(tōng)過 NPRC 缺失可(kě)産生更好的(de)有益效果。

由于 NPRC 缺失通(tōng)過不同的(de)機制激活 cAMP/PKA 和(hé) cGMP/PKG 信号的(de)傳導，研究人(rén)員(yuán)假設激活的(de) cAMP/PGA 和(hé) cGMP/PKG 信号轉導都可(kě)能上調 TGIF1 的(de)表達。爲了(le)驗證這(zhè)一假設，研究人(rén)員(yuán)進行了(le)體外實驗，首先用(yòng) forskolin (一種 cAMP 激動劑) 和(hé) H89 (一種 PKA 拮抗劑)來(lái)處理(lǐ) NRCF 或 hiPSC CF 細胞。結果表明(míng) forskolin 顯著激活了(le) PKA 信号傳導，可(kě)用(yòng) p-PKA 底物(wù)和(hé) p-CREB 水(shuǐ)平的(de)增加來(lái)驗證，而 H89 逆轉了(le) forskolin 誘導的(de) PKA 信号轉導的(de)激活。此外 forskolin 增加了(le) TGIF1 的(de)蛋白表達，但降低了(le) p-Smad2/3 的(de)表達。這(zhè)兩者都可(kě)被 H89 處理(lǐ)所抵消。此外 forskolin 降低了(le) TGF-β1 的(de)表達水(shuǐ)平，而 H89 也(yě)消除了(le)這(zhè)種表達水(shuǐ)平(圖 9)。這(zhè)些結果表明(míng) PKA 的(de)激活通(tōng)過抑制 TGF-β1 和(hé)增強 TGIF1 的(de)表達來(lái)抑制 TGF-β1/Smad 信号傳導。

圖9

本研究中所使用(yòng)的(de) NPRC KO 條敲小鼠由北(běi)京唯尚立德提供，該小鼠是在 C57BL/6 的(de)背景下(xià)通(tōng)過 CRISPR/Cas 9 技術構建而成的(de)。北京天糧生物科技有限公司是擁有多(duō)年的(de)基因編輯經驗，已爲數千名科研工作者及工業客戶成功定制基因編輯模型，同時(shí)搭建了(le)完善的(de)基因工程動物(wù)創制平台、動物(wù)表型分(fēn)析和(hé)實驗技術服務平台、動物(wù)模型種源交流平台、實驗動物(wù)繁育平台，歡迎您緻電咨詢。