複旦大(dà)學基礎醫學院生理(lǐ)與病理(lǐ)生理(lǐ)學系孫甯老師的(de)課題組在Protein & Cell 發表了(le)研究論文 “Isogenichuman pluripotent stem cell disease models reveal ABRA deficiency underliescTnT mutation-induced familial dilated cardiomyopathy”,研究了(le) ABRA 基因在 cTnT 突變所誘導的(de)家族性擴張型心肌病中所發揮的(de)重要作用(yòng)。擴張型心肌病(DCM)是一種常見的(de)遺傳性心肌病。在過去的(de)幾十年中，已經發現編碼肌小節、細胞骨架和(hé)通(tōng)道蛋白等的(de)各種基因的(de)單突變與 DCM 相關。然而，肌小節或結構基因中的(de)單個(gè)突變是如何導緻該疾病産生的(de)機制，目前仍然是并不特别明(míng)确的(de)。家族性心肌病中一個(gè)常見的(de)現象是，同一基因上的(de)不同單突變有時(shí)會導緻 DCM 有時(shí)又會導緻肥厚型心肌病(HCM) 的(de)發生。它們表現出幾乎相反的(de)疾病表型 DCM 的(de)特征是心肌和(hé)隔膜變薄、心室擴張和(hé)收縮功能障礙，而 HCM 表現出心肌和(hé)隔膜增厚、心室腔縮小和(hé)舒張功能障礙。在細胞水(shuǐ)平上 HCM 心肌細胞表現出同心肥大(dà)，其特征是肌絲平行組裝和(hé)肌細胞變寬，相比之下(xià) DCM 心肌細胞卻表現出偏心肥大(dà)，肌絲串聯組裝和(hé)肌細胞伸長(cháng)。

編碼 cTnT 的(de)基因 TNNT2 是可(kě)以明(míng)确心肌病表型分(fēn)支的(de)基因之一。研究發現 TNNT2 的(de)一個(gè)等位基因中的(de)賴氨酸 210 (ΔK210)的(de)缺失會導緻家族性 DCM 的(de)産生。攜帶這(zhè)種雜(zá)合突變的(de)患者表現出擴張的(de)心室和(hé)收縮功能障礙，從而會導緻具有高(gāo)死亡率的(de)進行性心力衰竭的(de)産生。相反 TNNT2 的(de)一個(gè)等位基因中谷氨酸 160 (ΔE160)的(de)缺失會導緻 HCM 的(de)發生。先前的(de)研究表明(míng) ΔK210 突變和(hé) ΔE160 突變會導緻相反的(de)肌絲對(duì) Ca2+ 的(de)敏感性以及力的(de)産生，因此在宏觀上就可(kě)能會表現出相反的(de)疾病表型。由這(zhè)兩種不同的(de) cTnT 突變所引起的(de)明(míng)顯不同的(de)心肌病的(de)表型，爲研究人(rén)員(yuán)探索觸發 DCM 疾病發展的(de)詳細分(fēn)子基礎提供了(le)一個(gè)很好的(de)模型。
爲了(le)研究這(zhè)種疾病分(fēn)化(huà)的(de)關鍵因素，研究人(rén)員(yuán)通(tōng)過 TALEN 介導的(de)基因編輯技術構建了(le)攜帶 cTnT-ΔK210 or cTnT-ΔE160 突變的(de)人(rén)胚胎幹細胞系(hESC)。這(zhè)排除掉了(le)來(lái)自同一家族的(de)個(gè)體間的(de)誘導多(duō)能幹細胞 (iPSC) 間的(de)遺傳變異。使用(yòng)靶向 PGK-Puro 元件的(de)探針所進行的(de) Southern 印迹實驗證實了(le)，在基因組内并沒有發生非特異性的(de)整合。對(duì)這(zhè)些細胞系的(de)測序分(fēn)析進一步對(duì)它們的(de)雜(zá)合和(hé)純合性進行了(le)驗證(圖 1 A)。接下(xià)來(lái)，研究人(rén)員(yuán)将雜(zá)合子和(hé)純合子的(de) cTnT-ΔK210 and -ΔE160hESC 向心肌細胞進行了(le)分(fēn)化(huà)誘導, cTnT-∆K210and -∆E160 hESC-cardiomyocytes 細胞表現出異常的(de)搏動特征(圖 1 B)，這(zhè)表明(míng)了(le)這(zhè)兩種突變與心律失常的(de)相關性。爲了(le)檢查 ∆K210 and ∆E160 突變是否會對(duì)肌絲的(de)組裝産生影(yǐng)響，研究人(rén)員(yuán)對(duì)來(lái)源于兩種突變 hESC 的(de)心肌細胞中的(de)肌節蛋白 cTnT and α-actinin 進行了(le)免疫染色分(fēn)析。與 WT hESC-cardiomyocytes 相比 cTnT ΔK210 and -ΔE160的(de)心肌細胞中表現出了(le)不同的(de)肌小節組織的(de)表型(圖 1 C)。突變程度相對(duì)較低的(de)雜(zá)合 TNNT2WT/ΔK210心肌細胞就表現出了(le) DCM 的(de)一些特征标志，例如 較少的(de)肌原纖維、更不規則的(de)肌小節組裝的(de)破壞以及 cTnT 在細胞内的(de)點狀分(fēn)布，而這(zhè)些在純合 TNNT2ΔK210/ΔK210的(de)心肌細胞中更爲明(míng)顯(圖 1 D)。通(tōng)過透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)細胞超微結構的(de)分(fēn)析，可(kě)以發現ΔK210 心肌細胞表現出了(le)相對(duì)不規則的(de) Z 線和(hé)膨脹的(de)内質網(圖 1 E)。相比之下(xià)，雜(zá)合的(de)TNNT2WT/ΔE160心肌細胞則顯示出了(le)相對(duì)更密集的(de)肌原纖維和(hé)加厚的(de) Z 線，而純合的(de) TNNT2ΔE160/ΔE160心肌細胞則顯示出了(le)明(míng)顯被破壞的(de)肌原纖維和(hé) Z 線(圖 1 E)。
對(duì)于心肌細胞的(de)功能，與 WT 心肌細胞相比，雜(zá)合和(hé)純合的(de) cTnT-ΔK210 心肌細胞都表現出了(le)減弱的(de)相對(duì)收縮力，而 cTnT-ΔE160 心肌細胞卻表現出了(le)增加的(de)收縮力(圖 1 F)。此外 cTnT-∆K210 and -∆E160 心肌細胞在分(fēn)化(huà)後的(de)第 35 天表現出了(le)不同的(de) Ca2+ 的(de)處理(lǐ)特性和(hé)更不規則的(de) Ca2+ 瞬變(圖 1 G and 1 H)。總體而言，這(zhè)些結果表明(míng)，雜(zá)合的(de) ∆K210 and ∆E160 心肌細胞分(fēn)别在很大(dà)的(de)程度上再現了(le) DCM and HCM 的(de)細胞表型，而純合的(de)∆K210 and ∆E160 心肌細胞則表現出了(le)更嚴重但也(yě)異常的(de)細胞表型。
由于 DCM 或 HCM 在患者發病過程中是逐漸的(de)進展的(de)，所以研究人(rén)員(yuán)猜想，參與早期疾病的(de)進展和(hé)分(fēn)化(huà)的(de)基因，将是幹擾該疾病進展的(de)比較有價值的(de)靶标。在此次的(de)研究中，研究人(rén)員(yuán)使用(yòng)了(le)∆E160 心肌細胞來(lái)作爲對(duì)照(zhào)，以尋找在 DCM 的(de)發展過程中參與疾病的(de)早期進展的(de)關鍵基因。通(tōng)過使用(yòng) RNA 測序技術，研究人(rén)員(yuán)對(duì)第 14 天和(hé)第 35 天的(de) ∆K210 and ∆E160心肌細胞來(lái)進行了(le)全轉錄組的(de)測序分(fēn)析。第 14 天和(hé)第 35 天的(de)心肌細胞表現出了(le)非常不同的(de)基因表達的(de)模式，并且可(kě)以被自動地分(fēn)爲兩大(dà)簇(圖 1 I and 1 J)，這(zhè)表明(míng)了(le)它們處于不同的(de)發育階段。在第 35 天的(de)心肌細胞的(de)表達簇内，則開始顯示出不同的(de)基因表達的(de)模式，幾乎可(kě)以被自動地分(fēn)類爲WT, ΔK210 DCM and ΔE160 HCM 組(圖 1 I and 1 J)。爲了(le)進一步來(lái)縮小，與 DCM and HCM 早期疾病進展和(hé)分(fēn)化(huà)相關的(de)候選基因的(de)篩選範圍，接下(xià)來(lái)，研究人(rén)員(yuán)比較了(le)在分(fēn)化(huà)後的(de)第 35 天(此時(shí)疾病已經産生了(le)分(fēn)化(huà))的(de)ΔK210 and ΔE160 心肌細胞中的(de)那些差異表達的(de)基因，并重點尋找那些表現出相反表達模式的(de)基因。如(圖 1 K), 有 74 個(gè)表達模式發生了(le)改變的(de)基因，但其中隻有 3 個(gè)基因的(de)表達方向發生了(le)反向。在這(zhè) 3 個(gè)基因中 ABRA 在 TNNT2WT/ΔK210 DCM 心肌細胞中被下(xià)調，而在 TNNT2WT/ΔE160 HCM 心肌細胞中被上調。其他(tā)兩個(gè)基因 HRASLS5 and AZGP1 與代謝密切相關，在 TNNT2WT/ΔK210 DCM 心肌細胞中表達上調，而在 TNNT2WT/ΔE160 HCM 心肌細胞中表達下(xià)調(圖 1 K 與 ABRA 的(de)模式相反)。這(zhè)三種基因 ABRA, AZGP1 and HRASLS5 在第 35 天的(de)心肌細胞中的(de)表達模式，通(tōng)過定量 PCR 又被進一步進行了(le)驗證(圖 1 L)。由于 ABRA 在患者的(de)骨骼肌肥大(dà)中被證明(míng)會發生上調而在萎縮中會産生下(xià)調，而這(zhè)與心肌的(de)肥大(dà)和(hé)擴張密切對(duì)應，所以研究人(rén)員(yuán)推測 ABRA 在早期的(de)疾病分(fēn)化(huà)的(de)階段會有非常重要的(de)作用(yòng)。
ABRA 是一種心髒和(hé)骨骼肌特異性的(de)肌動蛋白的(de)結合蛋白，它特異的(de)定位于 Z 線和(hé) M 線，并直接結合肌動蛋白。先前的(de)研究表明(míng) ABRA 通(tōng)過促使 MRTF-A and -B 的(de)核易位來(lái)激活 Rho 信号通(tōng)路的(de)傳導和(hé)血清反應因子(SRF)介導的(de)轉錄。ABRA 還(hái)可(kě)以通(tōng)過增加 G-actin 結合到 F-actin 來(lái)促進肌動蛋白的(de)聚合，增強橫紋肌細胞的(de)肌絲強度，并調節心髒對(duì)應激信号的(de)反應，這(zhè)表明(míng) ABRA 在這(zhè)些過程中可(kě)能充當了(le)應激傳感和(hé)細胞内信号調節的(de)細胞骨架中介體的(de)功能。與WT 心肌細胞相比, ABRA 表現出一種條紋狀的(de)定位模式，但傾向于定位于 TNNT2WT/∆K210細胞的(de)中心，并且在 TNNT2∆K210/∆K210細胞中該模式受到了(le)更大(dà)的(de)破壞。在 cTnT-ΔK210 心肌細胞中,ABRA and cTnT 蛋白的(de)水(shuǐ)平也(yě)發生了(le)降低。而在 cTnT-ΔK210 心肌細胞中使用(yòng)慢(màn)病毒來(lái)過表達 ABRA 能挽救與 DCM 相關的(de)細胞表型，例如 肌小節解體, cTnT 的(de)點狀分(fēn)布和(hé)收縮力降低。因此，研究人(rén)員(yuán)推斷 cTnT-ΔK210 心肌細胞中ABRA 的(de)下(xià)調減少了(le) F-actin 的(de)形成，并可(kě)能直接削弱了(le)肌絲的(de)結構，從而導緻了(le)細胞收縮性的(de)降低和(hé) DCM 相關表型的(de)産生。
圖1
研究人(rén)員(yuán)接下(xià)來(lái)研究了(le)，在心髒特異性的(de)表達 ABRA 是否可(kě)以在體内逆轉 cTnT-ΔK210 DCM 小鼠的(de)疾病表型。結果顯示 cTnT-ΔK210 小鼠中 ABRA蛋白減少。在 cTnT-ΔK210 小鼠中用(yòng) α-actinin 來(lái)染 Z 線及用(yòng)TMOD1 來(lái)染 A 帶，結果進一步表明(míng)了(le) Z 線是相對(duì)完整的(de)，但 A 帶受到了(le)破壞。接著(zhe)，構建了(le)由在心髒中特異性表達的(de) cTnT 啓動子所驅動的(de) ABRA 表達的(de)腺相關病毒載體(AAV9-ABRA)，并同時(shí)構建了(le) cTnT 啓動子驅動熒光(guāng)素酶表達的(de) AAV9-Luci 載體來(lái)作爲對(duì)照(zhào)。在小鼠出生後的(de)第 2-3 天通(tōng)過腹腔注射的(de)方式來(lái)導入 AAV 表達載體。而僅在心髒中檢測到了(le)熒光(guāng)素酶蛋白的(de)表達，這(zhè)驗證了(le)病毒的(de)有效性。
圖2
本研究中所使用(yòng)的(de) cTnT-K210 knock-in 小鼠由北(běi)京唯尚立德提供，該小鼠在 Balb/c 的(de)背景下(xià)通(tōng)過 TALEN 技術構建而成的(de)。北京天糧生物科技有限公司是擁有多(duō)年的(de)基因編輯經驗，已爲數千名科研工作者及工業客戶成功定制基因編輯模型，同時(shí)搭建了(le)完善的(de)基因工程動物(wù)創制平台、動物(wù)表型分(fēn)析和(hé)實驗技術服務平台、動物(wù)模型種源交流平台、實驗動物(wù)繁育平台，歡迎您緻電咨詢。
原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s13238-021-00843-w





                       



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